海上石油勘探与开发及航运事故中的大量溢油污染物进入河口、海湾和近岸海域，使得沿海海域的水质、底质和生态环境不断恶化，我国近海承受着前所未有的环境污染压力。据估计，全世界每年约有1.0×10¹⁰kg的石油进入海洋环境中，我国每年排入海洋的石油达1.15×10⁸kg，并且呈增长的趋势，某些海湾由于石油污染导致环境恶化、生物绝迹^[1]。与物理修复，化学修复相比，生物修复以其投入小，无二次污染的优势被视为最有前途和经济有效的环境治理方式^[2]。自20世纪90年代，生物修复技术在石油污染治理方面逐渐成为技术核心，取得了一些理论突破和重要成果^[3]。

渤海湾是渤海三大海湾之一，在渔业资源生产中的地位非常重要。然而近几十年来，随着社会经济的迅速发展，大量污染物质被排入渤海湾中^[4]。2011年6月，渤海湾的康菲石油公司蓬莱19-3号油田发生重大漏油事故。在超过半年的时间内，渤海被污染的海域从最初的16 km²蔓延到超过6200 km²，对渤海湾海洋环境造成了诸多影响^[5]。

分离海洋石油降解菌是对海洋石油污染进行生物修复的主要研究方式，降解菌对石油组分中不同烃类物质的代谢途径及降解机制存在差异，石油降解菌主要通过末端氧化、次末端氧化、双末端氧化以及直接脱氢作用等降解方式对石油进行降解^[6]。海洋环境中已经分离出的石油降解菌有食烷菌(Alcanivorax)^[7]、嗜油菌属(Oleiphilus)^[8]、油螺旋菌属(Oleispira)^[9]、解环菌属(Cycloclasticus)^[10]等，多为专性降解烷烃或专性降解多环芳烃的菌株。

本研究通过从渤海湾不同油污区分离筛选出高效降解烷烃、环烃及芳香烃的石油降解菌，并对其降解特性进行分析，旨在为石油污染生物修复提供科学依据和技术支持。

1   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   样品

含油水样采自天津滨海新区渤海石油海工码头近岸海域表层水面；油样采自天津大港油田采油区打桩锥液压动力站测试区；水油泥混合样采自渤海湾海洋石油勘探船废油收集区。

原油样品取自大港油田第三采油厂，为低硫环烷基类型，油品呈粘稠状，深棕色，密度0.949 g/cm³，石蜡含量5.6%，胶质含量22%，不含沥青质。

1.1.2   培养基

人工海水培养基^[11]：NaCl 24 g/L，MgSO₄·7H₂O 7 g/L，NH₄NO₃ 1 g/L，KCl 0.7 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，Na₂HPO₄ 3 g/L，去离子水1L，pH 7.2；微量元素混合溶液：CaCl₂ 2 mg/L，FeCl₃·6H₂O 50 mg/L，CuSO₄ 0.5 mg/L，MnCl₂·4H₂O 0.5 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 10 mg/L，去离子水1L；富集培养基为人工海水培养基灭菌后补加适量微量元素混合液5 mL/L，微量元素混合液经0.22 μm滤膜过滤除菌，并加入1%原油^[12]作为唯一碳源；分离培养基为富集培养基中加1.5%琼脂；牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，无水葡萄糖2.5 g，NaCl 3 g，蒸馏水1000 ml，pH 7.2，高压蒸汽灭菌。

1.2   方法

1.2.1   菌株的富集与分离

分别取5 mL水样、油样和水油泥混合样培养于100 mL富集培养基中，于28 ℃、130 r/min条件下震荡培养10 d。待培养液混浊后取1%转接至新鲜富集培养液中，按上述条件转接富集3次。采用稀释倒平板法进行菌株分离，将培养液梯度稀释后，取0.1 mL稀释液涂布于分离培养基中培养至长出菌落，选取不同形态特征的单菌落在牛肉膏蛋白胨培养基中划线培养纯化，纯化后的单菌落再回接到富集培养基中，若能正常生长即为石油降解菌株。

1.2.2   菌株的形态学与生理生化分析

对筛选出的菌株进行形态学观察和生理生化鉴定^[13]。

1.2.3   菌株的系统发育学分析

将分离纯化后的菌株在牛肉膏蛋白胨培养基中活化，用细菌DNA提取试剂盒(AxygenScientific)提取基因组DNA，以正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTTGGCTCAG-3’和反向引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’对其16SrRNA进行常规PCR扩增。PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测并送华大基因公司测序。在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)与RDP(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)数据库中通过BLAST进行序列相似性分析，利用MEGA6软件构建系统进化树，采用Neighbour-Joining方法建树，Bootstrap采用1000次。

1.2.4   石油烃组分变化测定：

将100 mL人工海水培养基于1×10⁵Pa灭菌20 min后，加入1%灭菌后的原油，实验组加入100 μL菌液(OD₆₀₀=1.0)，不加菌液的培养基作为对照组，28℃、130 r/min震荡培养10 d后，正己烷萃取残油组分，0.22 μm滤膜过滤，4℃保存。采用GC-MS内标法^[14-15]对残油组分进行含量分析，异三十烷作为内标物。GC-MS的检测条件为：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱；载气为氦气；柱流速为1 mL/min。质谱检测条件：进样量为1 μL。柱温为程序升温：30℃(保留10 min)升至100℃时，升温速率为5℃/min；100℃升至200℃时，升温速度为20℃/min；200℃升至280℃时，升温速率为30℃/min；最后尾吹10 min。测得各组分浓度后，用以下公式^[16-17]计算降解率：

式中：C_ck为对照组中烷烃的浓度(mg/L)；C_T为实验组中烷烃的浓度(mg/L)；A_T与A_ck分别为实验组与对照组中GC-MS中分析物的峰面积；A_T内标与A_ck内标分别为实验组与对照组中GC-MS中的内标物的峰面积；D为菌株的降解率(%)。

1.2.5   菌株的降解趋势

将降解效果最好的菌株接种到富集培养基中，分别于3 d，6 d，9 d测定其降解率。

2   结果与讨论

2.1   菌株的分离与形态

从不同油污区的水样、油样、水油泥混合样中共得到28株可降解石油的菌株，经过多次富集培养以及分离纯化，最终筛选出降解效果较好的3株菌：Tust-DW04、Tust-DC12、Tust-DM21。该3种菌株的菌落和电镜扫描结果见图 1。通过菌落形态观察可看出Tust-DW04为乳白色，不透明，表面光滑有光泽，而Tust-DC12无光泽，Tust-DM21边缘不规则，且颜色为乳黄色。扫描电镜观察，3株菌株均为杆状。

图  1  菌株Tust-DW04, Tust-DC12与Tust-DM21的菌落(左)及电镜图(右)

Fig.  1  Colonies morphology (left) and SEM images (right) of the strain Tust-DW04, Tust-DC12 and Tust-DM21

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2.2   生理生化鉴定

3株菌的生理生化特征见表 1。3株菌均为革兰氏阴性菌，3株菌在甲基红、蛋白酶、酯酶以及荧光色素等生化特征方面均有所不同，其中菌株Tust-DM21接触酶活性相对最高。通过菌株的生理生化特性对比，发现3株菌均与不动杆菌相似。

表  1  菌株Tust-DW04, Tust-DC12与Tust-DM21的生理生化特性

Tab.  1  Physiological and biochemical characteristics of the strain Tust-DW04, Tust-DC12 and Tust-DM21

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2.3   菌株的分子生物学鉴定

对3株菌株的16SrRNA进行PCR扩增得到约1.4 kb的DNA片段，通过BLAST在NCBI与RDP数据库中进行序列相似性搜索，发现与不动杆菌属的Acinetobacter beijerinckii序列相似性均为99%。经系统发育树(如图 2所示)分析发现3株菌与不动杆菌属(Acinetobacter)亲缘关系较近，但其分枝可信度不高，推测这3株菌可能为新的不动杆菌属种类，具体分类情况还需进一步研究。结合生化特性分析结果，将3株菌初步鉴定为Acinetobacter sp. Tust-DW04、Acinetobacter sp.Tust-DC12、Acinetobacter sp.Tust-DM21，3株菌的16SrDNA序列已提交NCBI数据库，登录号分别为：KX390864、KX390868和KX390866。

图  2  菌株Tust-DW04, Tust-DC12与Tust-DM21的16SrRNA系统发育树

Fig.  2  The 16SrRNA phylogenetic tree of the strain Tust-DW04, Tust-DC12 and Tust-DM21

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2.4   石油烃组分变化测定

2.4.1   原油中烷烃降解率

通过GC-MS检测分析可知(图 3)，3株降解菌能降解绝大部分C10~C30的烷烃，且都有较高烷烃降解能力。

图  3  菌株Tust-DW04, Tust-DC12与Tust-DM21降解烷烃的GC-MS图谱

Fig.  3  The graph of GC-MS monitoring the alkanes degradation by the strain Tust-DW04, Tust-DC12 and Tust-DM21

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通过3株降解菌对原油中不同烷烃降解率的分析(图 4)可知，菌株Tust-DC12对短链烷烃的降解率较高，对C11~C17的降解率可达96%，但对C18以上的烷烃降解能力较弱，并随着链长的增加降解率逐渐降低。菌株Tust-DW04的烷烃降解率相对较低，但对C18的降解效果较高，可达86%。石油污染物成分复杂，其中烷烃组分占很大一部分，而菌株Tust-DM21则对短、中、长链烷烃均有很强的降解效果，其对各个烷烃的降解率均在92%~99%之间，对于C12~C24之间的降解率均在99%以上，几乎可完全降解中链烷烃。

图  4  菌株Tust-DW04，Tust-DC12与Tust-DM21对石油烃中C10~C30烷烃的降解率

Fig.  4  Degradation for C10~C30 alkanes of the petroleum-hydrocarbon component by the strain Tust-DW04, Tust-DC12 and Tust-DM21

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2.4.2   原油中环烃降解率

结果表明，3株降解菌对环烃也同样具有较好的降解效果，并且菌株Tust-DM21对环烃的降解率最高，对己基环己烷降解率可达98%(图 5)。

图  5  菌株Tust-DW04, Tust-DC12与Tust-DM21对石油烃中环烃组分的降解效果

Fig.  5  Degradation for cycloalkanes of the petroleum-hydrocarbon component by the strain Tust-DW04, Tust-DC12 and Tust-DM21

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2.4.3   原油中芳香烃降解率

石油是由烷烃、环烷烃、烯烃、芳香烃等组成的复杂混合物，其中芳香烃是石油中最难降解的组分之一。结果表明，3株降解菌对芳香烃有着较好的降解效果。此外3株菌对二甲基萘和三甲基萘等多环芳烃的降解效果(84%)要好于三甲苯的降解效果(76%)(图 6)，表明这些降解菌株对多环芳烃的降解能力比较突出。

图  6  菌株Tust-DW04, Tust-DC12与Tust-DM21对石油烃中芳香烃的降解效果

Fig.  6  Degradation for aromatics of the petroleum-hydrocarbon component by the strain Tust-DW04, Tust-DC12 and Tust-DM21

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2.4.4   菌株的降解能力

分析菌株对石油烃中烷烃、环烃、芳香烃的总体降解效果，可得出3株降解菌的降解能力大小为Tust-DM21＞Tust-DC12＞Tust-DW04，其中Tust-DM21对烷烃的降解率可达98%，对环烃和芳香烃的降解率可达88%。3株降解菌对石油烃中各组分的降解效果也不相同，对烷烃的降解能力最强，其次为芳香烃，对环烃的降解最弱(图 7)。

图  7  菌株Tust-DW04, Tust-DC12与Tust-DM21对石油烃化合物中烷烃、环烃和芳香烃等组分的降解

Fig.  7  Degradation for alkanes, cycloalkanes and aromatics of the petroleum-hydrocarbon component by the strain Tust-DW04, Tust-DC12 and Tust-DM21

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2.5   菌株Tust-DM21的降解趋势

前述研究表明，菌株Tust-DM21对石油烃化合物的降解效果要优于菌株Tust-DW04和菌株Tust-DC12。为进一步分析菌株Tust-DM21的突出降解能力，我们研究了其降解趋势。

菌株Tust-DM21在生长3 d、6 d和9 d后对石油烃中各组分的降解效果各不相同。在培养3 d时，菌株对短链与中长链C10~C26的降解率已达80%以上，要明显高于C30长链的降解率35%(图 8)，培养9 d时，菌株对C10~C26烷烃的降解率已达92%。菌株Tust-DM21在培养3 d时对环烃的降解率可达78%(图 9)，对芳香烃的降解率可达76%(图 10)，在6 d时降解芳香烃达最大值89%，在9 d时降解环烃达最大值88%。Tust-DM21菌株对烷烃，环烃，芳香烃都有较强的降解能力，是一株具有较好开发前景的石油降解菌。

图  8  菌株Tust-DM21对烷烃(C10-C30)的降解情况

Fig.  8  Degradation for C10-C30 alkanes by the strain Tust-DM21

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图  9  菌株Tust-DM21对环烃的降解情况

Fig.  9  Degradation for cycloalkanes by the strain Tust\DM21

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图  10  菌株Tust-DM21对芳香烃的降解情况

Fig.  10  Degradation for aromatics by the strain Tust-DM21

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2.6   讨论

海洋石油污染已成为一个普遍且严峻的问题，石油烃在海洋环境中的转化极为复杂，主要通过物理、化学和生物过程消除。通过蒸发和光氧化，一部分烃从海水中消失，另一部分烃溶解分散于海水和沉积物中^[18]。经过长期的风化，海洋环境中的烃会逐渐减少，但速度极慢，因而石油烃的清除主要依赖于微生物的降解^[19]。许多微生物能以烃类为唯一碳源和能源生长，在自然界分布广泛。目前已从海洋中筛选出的石油烃降解菌主要有假单胞杆菌属(Pseudomonas)、食烷菌属(Alcanivorax)、不动杆菌属(Acinetobacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等^[20-23]。本研究通过对渤海石油污染区域的降解菌进行富集分离，得到降解效果较好的3株菌Tust-DW04、Tust-DC12、Tust-DM21，均属于不动杆菌属(Acinetobacter)。对于不动杆菌属细菌降解石油烃化合物的研究已有报道，Nkem等^[24]分离出的降解菌Acinetobacter baumannii对烷烃的降解率为58%；Huang等^[25]对新疆石油污染区分离出的降解菌Acinetobacter beijerinckii ZRS进行了优化，优化后对石油的降解率最高为80%。而本研究中分离得到的3株降解菌对石油烃的降解相对较好，降解率均在70%以上。

本研究分离的3株降解菌对石油烃各组分的降解以烷烃最易降解，其次为芳香烃，环烃最难降解，该结果与李慧等^[26]对石油降解菌的研究结果一致。在本研究中，菌株Tust-DM21作为一株高效石油降解菌，对正构烷烃、芳香烃、环烃均有较强的降解能力。已有研究表明，烷烃降解菌对烷烃的降解率为70%~90%^{[12, 27]}，本实验室前期分离鉴定的烷烃降解菌Citrobacter sp. TUST-S5对C20以上的长链烷烃降解率为88%，而菌株Tust-DM21对烷烃的降解率可达98%，具有明显优势。菌株Tust-DM21培养10 d时对环烃的降解率高达88%，而同类研究中对环烃降解率仅为60%~70%^{[26, 28]}。石油烃化合物中芳香烃和多环芳烃结构较复杂，石油降解菌对其降解效果相对较差。其中某一种组分的降解率较低，可能会影响芳香烃的整体降解效果。杨轩等^[29]分离的多环芳烃降解菌Pseudomonas aeruginosa BDP01在15 d内可累积降解89.64%的萘和77.21%的蒽，姜肸等^[12]分离得到的降解菌对多环芳烃的降解率为70%以上。而本研究中菌株Tust-DM21在10 d时对芳香烃的降解率可达88%，且对2-甲基萘的降解率可达94%。

本文针对分离菌株的降解特性作了初步分析，但其降解石油烃的代谢途径和降解机制仍需进一步研究。

3   结论

(1) 本研究从渤海湾不同石油污染区域分离纯化得到3株降解菌，分别为Tust-DW04，Tust-DC12，Tust-DM21，经鉴定均属于不动杆菌属(Acinetobacter)。

(2) 3株降解菌对石油烃的降解能力依次为Tust-DM21＞Tust-DC12＞Tust-DW04，3株降解菌对石油烃中各组分的降解效果依次为烷烃＞芳香烃＞环烃。

(3) Tust-DM21菌株对烷烃，环烃，芳香烃都有较强的降解能力，是一株具有较好开发前景的石油降解菌。