Distribution and antibiotic resistance of Escherichia coli and Enterococci isolated from fecal soil in Ny-Alesund, the Arctic
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摘要:
采用滤膜法对2012年北极黄河站科学考察采集的新奥尔松地区8个鹿粪和1个鸟粪样品进行分离鉴定，共获得84株肠球菌和85株大肠杆菌。84株肠球菌分属于10个属，其中屎肠球菌（28株）、鼠肠球菌（28株）及鸟肠球菌（10株）为优势菌。采用K-B纸片法对受试菌株进行药敏试验结果显示：85株大肠杆菌对利福平全部耐药，对氨苄西林的耐药率为81%；对甲氧苄啶（TMP）、喹诺酮类的萘啶酸（NAL）与环丙沙星（CIP）、四环素（TCY）4种抗生素高度敏感。84株肠球菌中屎肠球菌对氨苄西林耐药率最高（89%），对万古霉素耐药率最低（4%）。10株鸟肠球菌对利福平全部耐药，而28株鼠肠球菌对利福平耐药率最低（4%），对链霉素耐药率最高（75%）。18株其他肠球菌对利福平耐药率最高（61%）。上述结果表明抗生素耐药性已出现于北极新奥尔松地区野生动物肠道菌群中。
Abstract:A total of 85 isolates of Escherichia coli and 84 isolates of Enterococci were screened from one bird faeces and eight deer manure located in Ny-Alesund, Arctic of the fifth Arctic scientific expedition, using the membrane filtration method.Eighty-four Enterococci isolates were identified as Enterococcus faecium, Enterococcus ratti, Enterococcus avium, Enterococcus hirae, Entercoccus villorum, Entercoccus saccharolyticus, Entercoccus flavescens, Entercoccus dispar, Entercoccus sulfureus and Entercoccus PNS-E2 in ten genera.In addition, antimicrobial susceptibilites of isolates were determined through the K-B disk diffusion method.Among the 85 E.coli isolates, the resistant frequence to rifampicin and ampicillin was 100% and 81%, respectively. E.coli isolates were highly sensitive to trimethoprim (TMP), nalidixic acid (NAL), ciprofloxacin (CIP), and tetracycline (TCY). E.faecium isolates were resistant to 11 antibiotics, which of ampicillin resistant rate was highest (89%), of vancomycin resistance was the lowest (4%).Ten E.avium isolates were resistant to rifampicin.Among the 28 E.ratti isolates, 21 isolates were resistant to streptomycin with the highest rate, while the rifampicin resistance was the lowest (4%).The remaining 18 isolates of Enterococci were resistant to 7 common used antibiotics with the highest resistant rate (61%) to rifampicin.The above results suggested that antibiotic resistance occurred in the rectal microbial flora of local wildlife in Arctic.
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细菌耐药性已经成为一个全球性的问题。世界卫生组织 (WHO) 已将抗生素耐药性作为二十一世纪威胁人类健康的最大挑战之一，并宣布在全球范围内开展抗生素污染调查战略部署[1]。抗性基因作为一种新型环境污染物会对极地地区脆弱的生态系统及其环境造成破坏。对极地地区抗生素耐药性的研究，将有助于了解具有耐药性的细菌在极地的分布状况以及抗生素在海洋中的流动和全球变化问题。然而，由于极地地区特殊的严寒气候和地域限制，人们对极地地区微生物耐药性的调查研究也十分有限。中国对南极科考已经进行了32次，对北极科考也进行了6次，但对极地细菌耐药性方面研究较少[2]。而国外对极地地区细菌耐药性相关研究开展较早，并已获得大量细菌抗性数据。中国对南极科考已经进行了32次，对北极科考也进行了6次，但对极地细菌耐药性方面研究较少[2]。而国外对极地地区细菌耐药性相关研究开展较早，并已获得大量细菌抗性数据。如Jonas等人在南极企鹅粪便当中分离出的细菌检测到了耐药性[3]。Angelina等在南极浅层沉积物中分离的细菌检测到对氨苄青霉素和氯霉素的耐药[4]。Maria等发现北极鸟类的大肠杆菌携带抗生素耐药性基因[5]。Santina等在南极嗜冷菌中发现了抗生素抗性[6]，并有研究表明南极海水中存在具有耐药性的细菌[7]。
新奥尔松 (Ny-Alesund)，79°55′N, 11°56′E，位于斯瓦尔巴德群岛中最大岛屿的西岸，王湾冰川的末端。群岛多山地，沿岸多峡湾，近60%的区域被冰川覆盖，由于受流经群岛的北大西洋暖流的影响，该地区的气温比北极其他地区的要温和很多。这是地球上最北的人类社区，北极新奥尔松地区生活着2 500多人，每年7、8月份会有很多科考队及旅游观光者前来光顾，造成很大的人员流动，并且鸟类和其他动物的迁徙也可能将一些耐药性细菌带入了北极甚至影响了当地野生动物的肠道菌群微生态[8]，基于这一假设，本文将对北极第5次科考地野生动物鹿及鸟类粪便中的肠道菌群细菌耐药性进行调查，将有助于进一步了解北极地区细菌抗生素污染状况，为全球细菌耐药性监测系统提供重要数据。
1 材料与方法
1.1 样品采集
样品取自中国第5次极地科学考察黄河站 (2012年7月~9月)，样品类型为动物粪便 (祥见表 1)。采集后立即置于无菌自封袋中，在冰上运回实验室，冻存备用。
表 1 采样信息Tab. 1 Sample information
1.2 菌株的分离和纯化
将鸟粪样品做10-4稀释，鹿粪样品做10-3稀释用于分离大肠杆菌；将鸟粪样品做10-3稀释，鹿粪样品做10-2稀释用于分离肠球菌，将各站位粪便 (鸟粪、鹿粪) 样品的稀释液使用0.45 μm微孔滤膜各过滤100 mL，将培养大肠杆菌的滤膜置于m-TEC培养基上，于35±1 ℃水浴培养2 h，再以44.5±0.5 ℃培养16~18 h，大肠杆菌会形成黄色或黄棕色菌落；将培养肠球菌的滤膜置于肠球菌琼脂培养基上，于37 ℃培养48 h，肠球菌会形成黑棕色小菌落。于营养琼脂培养基上划线分离纯化。
1.3 生理生化鉴定
1.3.1 大肠杆菌的生化鉴定
将分离纯化的疑似大肠杆菌的菌株用肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管操作过程按照说明书进行。
1.3.2 肠球菌的生化鉴定
对分离纯化得到的疑似肠球菌菌株，用接种针挑取纯菌株接种于肠球菌细菌生化编码微量鉴定管，操作过程按照说明书进行。
1.4 大肠杆菌和肠球菌的药敏试验
1.4.1 抗生素选择
选取治疗大肠杆菌感染常用的10种药敏纸片：氨苄西林 (AMP)、利福平 (RIF)、庆大霉素 (GEN)、四环素 (TCY)、氯霉素 (CHL)、链霉素 (STR)、环丙沙星 (CIP)、头孢噻吩 (CEP)、萘啶酸 (NAL)、甲氧胺嘧啶 (TMP)。肠球菌选用11种常用的药敏纸片：氨苄西林 (AMP)、利福平 (RIF)、庆大霉素 (GEN)、四环素 (TCY)、氯霉素 (CHL)、链霉素 (STR)、环丙沙星 (CIP)、呋喃妥因 (NIT)、红霉素 (ERY)、万古霉素 (VAN)、青霉素 (PEN)。上述药敏纸片均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。
1.4.2 药敏试验
采用K-B纸片法对大肠杆菌及肠球菌进行药敏试验，严格按照美国临床标准委员会 (CLSI) 推荐的纸片扩散法操作程序进行。细菌药敏试验结果判定参照CLSI公布的标准以敏感 (susceptible)、中敏 (intermediate)、耐药 (resistant)3种形式对抑菌圈大小作出解释。采用WHONET 5.6软件进行药敏结果分析。药敏试验过程中分别使用大肠杆菌标准菌株ATCC 25922及肠球菌标准菌株ATCC 29212作为质控菌株。
2 结果与讨论
2.1 大肠杆菌和肠球菌的分离鉴定结果
对在m -TEC培养基上初筛得到的90株疑似大肠杆菌进行生理生化鉴定发现，85株为大肠杆菌，另外5株属于赫尔曼埃希氏菌，分离率为94%。其中10株大肠杆菌分离自1个鸟粪样品，75株大肠杆菌分离自8个鹿粪样品。这说明大肠杆菌在鸟粪及鹿粪样品中的分布较均一。
初筛的90株疑似肠球菌鉴定出84株肠球菌，它们分属于鸟肠球菌、屎肠球菌、鼠肠球菌、拉氏肠球菌、绒毛肠球菌、黄色肠球菌、殊异肠球菌、解糖肠球菌、肠球菌PNS-E2及硫磺肠球菌10个属。10株鸟肠球菌分离自1个鸟粪样品，其余74株肠球菌分离自8个鹿粪样品。鹿粪样品中屎肠球菌及鼠肠球菌均为优势菌，所占比例均为33%。R Iseppi等人对猫和狗的粪便中分离出的115株肠球菌进行生理生化鉴定发现屎肠球菌 (37%) 和粪肠球菌 (31%) 为优势菌[9]。这与本研究检测到鹿粪中屎肠球菌所占比例相似。Metiner等人发现在土耳其猪粪便中分离出的69株肠球菌中屎肠球菌 (67%) 为优势菌[10]。这表明屎肠球菌可能是哺乳动物粪便样品中的优势肠球菌。
2.2 北极粪土中大肠杆菌的耐药性分析
大肠杆菌药敏试验结果显示北极粪土中分离的85株大肠杆菌对利福平全部耐药，对氨苄西林的耐药率为81%；对头孢噻吩、链霉素、氯霉素、庆大霉素的耐药率均低于10%。分离菌株对甲氧苄啶 (TMP)、喹诺酮类的萘啶酸 (NAL) 与环丙沙星 (CIP)、四环素 (TCY) 这4种抗生素高度敏感。本研究受试菌株对利福平及氨苄西林显示出较高的耐药率，这可能与北极环境中利福平或氨苄西林结构相似的化学物质的残留量较多有关[11]。这说明临床上，畜牧业和水产养殖业等使用的抗生素类药物可能通过海洋地球化学循环进入到北极新奥尔松地区，并通过长期适应机制诱导了当地物种肠道菌群的细菌耐药性。在鸟粪中分离的10株大肠杆菌也具有耐药性，这与Maria等的研究结果相似，他们发现向北极白令海峡迁徙的候鸟可能携带耐药菌，并在北极候鸟粪便中检测到具有耐药性的大肠杆菌，对青霉素，氨苄青霉素，先锋霉素，磺胺类耐药[5]。David等人在澳大利亚检测623只迁徙的候鸟，其中有23%的鸟携带有耐药性大肠杆菌[12]。A.Lillehaug等在挪威野生鹿科动物的粪便样品中检测出具有耐药性的大肠杆菌，并且野生驯鹿中的耐药大肠杆菌 (24%) 比其他鹿科动物的多 (2%)，且对链霉素耐药率较高 (21%)[21]，这与本研究鹿粪中大肠杆菌抗生素抗性结果相似。野生动物大肠杆菌的抗生素抗性较低[13-14]，而与人类接触增多后耐药性会增加[15-20]。这说明北极新奥尔松地区可能因为人类活动和鸟类迁徙，导致当地野生动物肠道菌群出现耐药性。
表 2 大肠杆菌耐药率Tab. 2 E.coli resistance rates
2.3 北极粪土中肠球菌的耐药性分析
肠球菌耐药性结果显示28株屎肠球菌对11种抗生素均有耐药性 (表 3)，且对氨苄西林 (89%)，环丙沙星 (82%)，链霉素 (79%)，利福平 (75%) 和呋喃妥因 (68%) 的耐药率较高；28株鼠肠球菌对利福平、呋喃妥因、氯霉素、氨苄西林、链霉素、庆大霉素和环丙沙星7种抗生素具有耐药性，其中对链霉素和呋喃妥因的耐药率均超过60%，对其他抗生素全部敏感；10株鸟肠球菌全部对利福平耐药，对环丙沙星和庆大霉素的耐药率均为20%，对链霉素和万古霉素耐药率很低，对剩余抗生素没有耐药性；其他肠球菌对利福平耐药率较高，达到61%，其次对氨苄西林 (22%)、链霉素 (17%) 耐药，对呋喃妥因、青霉素、四环素和环丙沙星的耐药率均为6%，对剩余抗生素无耐药性。上述结果表明北极粪土中不同种类肠球菌耐药性差异较大。
表 3 肠球菌耐药率Tab. 3 Enterococci resistant rate
本研究分离的屎肠球菌对选取的11种抗生素均有耐药性，且耐药率较高，这与R Iseppi等人的研究中，屎肠球菌对红霉素和四环素耐药的结果相似[9]。A.Lillehaug等人在野生鹿粪中分离出4株具有耐药性的屎肠球菌，对黄霉素全部耐药，对土霉素和杆菌肽耐药率均为25%，耐药率较低[21]。Metiner等人在屎肠球菌中主要对红霉素和环丙沙星耐药，耐药率分别为94%和81%，其次对万古霉素耐药，耐药率为6%[10]。这与本研究中测得的鸟肠球菌和屎肠球菌的万古霉素耐药率相似。此外，大环内酯类的红霉素的细菌耐药率也很低，仅在屎肠球菌中有3株耐药菌。而在我国的研究中也有类似结论，2014年中国细菌耐药性监测网 (简称CHINET) 检测到肠球菌属中屎肠球菌对多数测试抗菌药物耐药率较高，且有少数万古霉素耐药株[22]。
3 结论
(1) 本文从北极新奥尔松地区8个鹿粪和1个鸟粪样品中共分离鉴定出85株大肠杆菌和84株肠球菌，其中85株大肠杆菌在鸟粪和鹿粪中的分布较均一；鸟粪中的肠球菌种类较单一；鹿粪中肠球菌种类多样，归属于10个不同的属，屎肠球菌为鹿粪中的优势菌。
(2) 分离的85株大肠杆菌对临床常用的6种抗生素耐药，且对利福平的耐药率达100%；84株肠球菌对11种抗生素均有耐药性，且耐药率较高，不同种肠球菌耐药性状况差异较大，上述结果表明抗生素耐药性已存在于北极地区野生动物肠道菌群中。
致谢: 感谢国家海洋环境监测中心姚子伟和那广水研究员赠送研究样品。 -
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