营养盐和Chl a是海洋调查中的基本参数，是认识海洋生态环境的基础。要获得真实可靠的调查数据，不仅要求测定方法精密准确，采样过程和样品预处理过程也是至关重要的^[1]。过滤作为营养盐和Chl a样品采集过程中重要的预处理步骤，滤膜的选取可能会对最终的测定结果产生重要影响^[2-3]。在海洋科学研究中，人为地定义海水中的“溶解态”为通过孔径为0.45 μm滤膜的成分^[4]。在实际的操作中，对滤膜的选择主要会考量孔径、材料、对测量参数的干扰以及花费等多个因素。例如，在营养盐的样品采集过程中，国内以醋酸纤维滤膜(0.45 μm)应用最为广泛^[5]；国际上以聚碳酸酯滤膜(0.4 μm)、纤维素膜应用较多^[6]，其中聚碳酸酯滤膜以孔径均匀、化学性质稳定、无纤维脱落、干扰小等优点应用越来越普遍。关于营养盐的测定，国际营养盐互校为各实验室营养盐测定方法的对比提供一个参考的平台，然而互校样品多为预处理好的样品，各个实验室在样品过滤过程中是否存在差异，我们还无从得知。本研究采用聚碳酸酯滤膜和醋酸纤维滤膜进行海水样品过滤，探究该两种常用的滤膜在测定营养盐和Chl a过程中是否存在差别。

1   材料与方法

1.1   滤膜预处理实验

本实验选取了两种滤膜进行过滤，分别是聚碳酸酯滤膜(0.4 μm，Whatman)和醋酸纤维滤膜(0.45 μm，国家海洋局杭州水处理技术开发中心)。为了测定滤膜自身是否会对过滤结果产生影响，采用两种滤膜过滤Milli-Q水，每种膜5个平行样，测定硝酸盐(NO₃-N)、亚硝酸盐(NO₂-N)、氨氮(NH₄-N)、磷酸盐(DIP)和硅酸盐(DSi)的变化(以未过滤的Milli-Q水做对照)，结果见表 1。实验结果表明，经聚碳酸酯膜过滤后的Milli-Q水NH₄-N浓度增加，平均值变为0.09 μmol/L，其他各项参数变化较小，均低于检测限。而经醋酸纤维滤膜过滤后，NO₃-N和NH₄-N都有了明显的升高，分别变0.52 μmol/L，0.83 μmol/L。为了减小醋酸纤维滤膜对过滤样品的影响，对其进行预处理，过程如下：醋酸纤维滤膜预先用pH=2的HCl浸泡24 h，然后用超纯水洗至中性后待用^[7]。采用酸处理后的滤膜过滤Milli-Q水的结果见表 1。所得结果与未处理的聚碳酸酯膜相近，过滤后的NH₄-N变0.09 μmol/L，其他各项营养盐参数变化较小，均低于检测限。因而在过滤实验中，聚碳酸酯膜不做预处理，醋酸纤维膜均需酸处理后使用。

表  1  Milli-Q水经两种滤膜过滤后的营养盐结果

Tab.  1  Nutrients results of ultrapure water filtered by polycarbonate membrane (0.4 μm) and cellulose acetate membrane (0.45 μm)

	营养盐浓度/μmol·L-1
	NO3-N	NO2-N	NH4-N	DIP	DSi
Milli-Q水	< 0.03	< 0.01	< 0.03	< 0.02	< 0.03
聚碳酸酯膜	< 0.03	< 0.01	0.09±0.01	< 0.02	< 0.03
醋酸纤维膜	0.52±0.09	< 0.01	0.83±0.09	< 0.02	< 0.03
醋酸纤维膜(酸处理)	< 0.03	< 0.01	0.09±0.01	< 0.02	< 0.03

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1.2   样品采集

2013年7月在黄海海域选取两个站位C01，C05取表层海水(图 1)，充分混合均匀，分别用干燥(45℃烘干)的聚碳酸酯滤膜(0.4 μm)和醋酸纤维滤膜(0.45 μm)进行过滤，每种膜5个平行样。所得滤膜对折后用铝箔包好，放于冰箱中(-20℃)避光冷冻保存，带回实验室测定Chl a；滤液冷冻后带回实验室测定溶解无机态营养盐。在过滤过程中发现，与聚碳酸酯膜相比，干燥的醋酸纤维滤膜过滤速度非常慢且截留颗粒物呈明显的斑块状分布。为避免滤膜干燥对测定结果造成的影响，于2014年3月在南海北部海域又选取了S01，S02站位进行实验，所用滤膜均未作干燥处理。其中NO₂-N、NH₄-N和DIP在船上实验室现场测定，滤液加饱和氯化汞保存后带回实验室测定NO₃-N和DSi，滤膜冷冻后带回实验室测定Chl a。为了深入探究两种滤膜截留效率之间的区别，于2015年6月在南海北部选取10个站位采用未干燥的滤膜进行过滤，取样层次为30~50 m，所得滤膜冷冻保存后带回实验室测定Chl a。

图  1  采样站位

(a.黄海海域：◇2013年7月航次；b.南海海域：△ 2014年3月航次，○ 2015年6月航次)

Fig.  1  Sample stations

(a.Yellow Sea:◇cruise in July 2013; b.South China Sea:△cruise in March 2014, ○cruise in June 2015)

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1.3   实验方法

溶解态营养盐的测定包括NO₃-N、NO₂-N、NH₄-N、DIP和DSi。NH₄-N采用次溴酸钠氧化法手工测定^[8]，检出限为0.03 μmol/L，精密度 < 3%。NO₃-N、NO₂-N、DIP和DSi分别采用Cd-Cu还原+重氮偶氮法、重氮偶氮法、磷钼蓝法、硅钼蓝法^[6]使用营养盐自动分析仪测定(2014年3月航次NO₂-N和DIP在船上现场测定，使用分光光度计测量)，检出限分别为0.03、0.01、0.02和0.03 μmol/L，精密度 < 2%。Chl a测定采用荧光法，即将滤膜放入15 mL离心管中，加入90%丙酮溶液10 mL，在冰箱冷藏室中萃取14~24 h。离心后，测定酸化前和酸化后的荧光值，计算Chl a浓度^[9]。此外，本实验采用扫描电镜(HITACHI S4800)对醋酸纤维膜和聚碳酸酯膜结构进行观测，分别测定两种滤膜过滤前和过滤后的结构变化。由于扫描电镜观测滤膜结构之前需要预先干燥，因而预先将滤膜放入烘箱中45℃烘干后进行测定。

2   结果与讨论

2.1   两种滤膜过滤前后结构的变化

图 2为通过扫描电镜观测到的两种滤膜在过滤Milli-Q水前后的结构变化。聚碳酸酯滤膜孔径均匀，化学性质较为稳定，过滤前后结构并未发生明显变化。醋酸纤维滤膜呈现多孔层结构，孔径不如聚碳酸酯膜均匀，在过滤前后，结构发生明显变化。由于制孔工艺不同，滤膜的结构也存在差别。聚碳酸酯滤膜是通过核径迹蚀刻法制备得来，即通过放射性同位素裂变产生的高能粒子撞击膜材料形成径迹，然后采用侵蚀剂腐蚀掉径迹处的本体材料，形成孔径均匀的膜孔，一次成型，物理结构不容易发生变化^[10]。而醋酸纤维滤膜作为纤维素类膜材料的一种，研究较早且应用广泛，其孔径的制备方法为溶出法，即通过向膜材料中混入水溶性或其他溶剂可溶的材料，成膜后将该材料溶出，形成多孔膜^[11]。醋酸纤维滤膜的材质一般为亲水性材质，吸湿性强，在预处理和过滤过程会发生溶胀，因此本实验观察到了醋酸纤维滤膜在过滤水体前后结构发生较大变化^[10]。

图  2  聚碳酸酯滤膜与醋酸纤维滤膜过滤前后的滤膜结构(扫描电镜HITACHI S4800)

Fig.  2  The structures of membranes polycarbonate membrane (0.4μm) and cellulose acetate membrane (0.45μm) before and after filtration. (SEM, HITACHI S4800)

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2.2   采用两种滤膜过滤营养盐的结果对比

采用聚碳酸酯滤膜和醋酸纤维滤膜过滤黄海和南海海域样品的营养盐结果如图 3所示，NO₃-N、NO₂-N、NH₄-N、DIP和DSi的变化范围分别为：0.10~9.54、 < 0.01~1.91、0.27~1.75、 < 0.02~0.41和0.89~12.62 μmol/L。在黄海海域采用干燥的聚碳酸酯滤膜和醋酸纤维滤膜进行对比，在南海海域采用未干燥的醋酸纤维滤膜和聚碳酸酯滤膜进行比较，所得结果采用t检验(双边)在置信度为95%的水平下进行显著性检验(表 2)。结果表明，采用干燥的聚碳酸酯滤膜和醋酸纤维滤膜过滤的NO₃-N、NO₂-N、NH₄-N均存在显著性差异(|t₁|_NO3-N=2.31 > 2.26；|t₁|_NO2-N=6.19 > 2.26; |t₁|_NH4-N=3.06 > 2.26)。醋酸纤维滤膜测定的NO₃-N、NO₂-N和NH₄-N偏高，分别高约0.06、0.02和0.18 μmol/L。从图 3也可以看出，干燥的醋酸纤维滤膜过滤后NH₄-N的平均值明显高于聚碳酸酯滤膜，在C01和C05站位分别高18%和63%。NH₄-N在海水中的含量较低，在采样和测定过程中极易被沾污^[12-13]。干燥的醋酸纤维滤膜过滤速度非常慢，在过滤过程中水样与滤膜及空气接触时间较长，NH₄-N容易被带进海水中。同样地，Sparrow等研究^[14]也证实滤膜材质是NH₄-N引入的一大原因。采用干燥的聚碳酸酯滤膜和醋酸纤维滤膜过滤的DSi不存在显著性差异(|t₁|_DSi=1.04 < 2.26)。在未干燥的聚碳酸酯滤膜和醋酸纤维滤膜对比结果中我们发现，采用两种滤膜过滤的NO₂-N、NH₄-N、DIP和DSi均不存在显著性差异(|t₂|_NO2-N=1.00 < 2.26；|t₂|_NH4-N=1.94 < 2.26; |t₂|_DIP=0.18 < 2.26; |t₂|_DSi=1.30 < 2.26)。虽然两种滤膜过滤的NO₃-N存在显著性差异(|t₁|_NO3-N=2.88 > 2.26)，但差别小于2%。因而，未干燥的醋酸纤维滤膜和聚碳酸酯滤膜均适合海水营养盐的过滤。

图  3  不同滤膜过滤海水样品营养盐结果的比较

(a.NO₃-N；b.NO₂-N；c.NH₄-N；d.DIP；e.DSi；PC 0.4-聚碳酸酯膜0.4 μm；CA 0.4-醋酸纤维膜0.45 μm；误差棒为5个平行样间的标准偏差)

Fig.  3  Comparison of nutrients concentrations between different filters

(a.NO₃-N; b.NO₂-N; c.NH₄-N; d.DIP; e.DSi; PC 0.4-polycarbonate membrane 0.4 μm; CA 0.4-cellulose acetate membrane 0.45 μm; error bars means the standard deviation of five samples)

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表  2  采用两种滤膜过滤营养盐的对比结果(t检验，双边)

Tab.  2  Contrast of nutrients results filtered by two kinds of filters (t-test, two-tails)

	NO3-N	NO2-N	NH4-N	DIP	DSi
t1	-2.31	-6.19	-3.06	---	-1.04
t2	-2.88	-1.00	1.94	-0.18	1.30
注：t(0.05, 9)=2.26。---表示磷酸盐浓度低于检测限，无法进行对比；t1--干燥的聚碳酸酯膜和醋酸纤维滤膜之间的结果对比；t2--未干燥的聚碳酸酯膜和醋酸纤维滤膜之间的结果对比

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2.3   采用两种滤膜过滤Chl a的结果对比

Chl a作为海洋中浮游植物生物量的重要指标，是海洋调查研究中基本参数之一^{[9, 15]}。有研究发现，虽然玻璃纤维滤膜(如GF/F)最常应用于植物色素和生物量观测的样品过滤，但由于其孔径较大，会导致微微型浮游植物无法完全被截留，从而使测得的生物量较低，而聚碳酸酯滤膜(0.4 μm)孔径小且均匀，会截留更多的浮游植物，因而更适合Chl a和生物量的测定^[16]。在黄海海域采用干燥的聚碳酸酯滤膜和醋酸纤维滤膜的对比结果表明醋酸纤维滤膜的截留效率较低：在C01站，约为聚碳酸酯滤膜的84%；而在C05站，仅为聚碳酸酯滤膜的15%。然而，在南海海域，未干燥的两种滤膜的截留效率并无显著性差异。推测原因可能有两个：(1)干燥的醋酸纤维滤膜不适合Chl a的过滤；(2)虽然两种滤膜孔径相近，但结构不同，浮游生物群落的粒级组成可能会影响滤膜的截留效率。此外在实际操作过程中我们发现，在测定Chl a酸化后的荧光值时，醋酸纤维滤膜加酸后会产生白色浑浊，部分滤膜摇晃后浑浊亦不消失，可能会对最终的测定值产生影响。有关滤膜孔径相同材质不同从而导致滤膜截留效率存在差异的现象在前人的研究中亦有提及^[17-18]。

图  4  不同滤膜过滤Chl a结果对比(PC 0.4-聚碳酸酯膜0.4 μm；CA 0.45-醋酸纤维膜0.45 μm)

Fig.  4  Comparison of chlorophyll a between different filters (PC 0.4-polycarbonate membrane 0.4 μm; CA 0.45-cellulose acetate membrane 0.45 μm)

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为了进一步探究两种滤膜之间的差别，在2015年6月份南海北部航次中，选取了10个站位的次表层水体过滤并测定Chl a，实验结果见图 5。聚碳酸酯膜和醋酸纤维膜过滤的结果分别为0.15~0.97和0.05~0.81 μg/L。与2014年春季调查结果不相同的是，在2015年夏季，醋酸纤维滤膜的截留效率明显低于聚碳酸酯滤膜，仅为聚碳酸酯滤膜的30%~84%，可能与不同季节不同区域浮游生物群落组成不同有关，推测小粒径的浮游植物如原绿球藻(0.6~0.7 μm)等可能是造成两种滤膜差别的主要原因^[16]。据研究^[19]发现，原绿球藻存在于南海除近岸外的全部海域，丰度为10⁴~10⁵/mL，丰度最大值常常存在于次表层(50 m左右)。2014年春季调查站位S01，S02均位于近岸且为表层水样，原绿球藻含量少，而在2015年6月的调查站位大多离岸较远且为次表层水，原绿球藻含量较高。无法完全截留全部的原绿球藻可能是造成醋酸纤维膜所得Chl a值低的主要原因。虽然醋酸纤维滤膜与聚碳酸酯滤膜孔径较为相近，但两种滤膜的结构存在差别，导致滤膜的Chl a截留效率也会不同。聚碳酸酯滤膜孔径较为均匀，而醋酸纤维滤膜孔径分布较宽，存在较大孔径的膜孔，因而无法完全截留住小粒径的浮游植物，从而造成了Chl a的损失。通过以上的对比结果表明，聚碳酸酯滤膜更适合Chl a的测定。

图  5  2015年6月10个站位的Chl a结果

Fig.  5  Chlorophyll a results at observation stations in June 2015

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3   结论

(1) 醋酸纤维滤膜在过滤过程中会引入较多的NO₃-N和NH₄-N，因而使用前需要酸处理，酸处理后的醋酸纤维滤膜和聚碳酸酯滤膜结果较为一致。

(2) 未干燥的醋酸纤维滤膜与聚碳酸滤酯膜测定营养盐结果十分接近，均适合海水溶解态营养盐的过滤。干燥的醋酸纤维滤膜并不适合营养盐的过滤，原因是过滤速度缓慢且过滤过程会引入较多的NH₄-N。考虑到两种滤膜的价格，醋酸纤维滤膜是测定溶解无机态营养盐的很好选择。

(3) 采用两种滤膜过滤Chl a的结果表明，聚碳酸酯滤膜更加适合Chl a的测定。醋酸纤维滤膜的截留效率低于聚碳酸酯滤膜，可能是由于无法全部截留小粒径浮游植物导致。