Biological accumulation and release of roxarsone in marine scallop (Chlamys farreri)
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摘要:
选取海洋双壳贝类栉孔扇贝为目标生物，研究不同质量浓度（0 mg/L、0.2 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、25 mg/L）的洛克沙胂暴露条件下，砷（As）在栉孔扇贝4种组织（肝胰腺、鳃、闭壳肌、外套膜）中的富集和释放规律。结果表明：（1）自然海域和在清洁海水中，栉孔扇贝4种组织中As含量排序均为鳃>肝胰腺>外套膜>闭壳肌。（2）富集过程中，As的组织含量排序为肝胰腺>鳃>外套膜>肌肉，释放过程中，As的组织平均释放率排序为鳃>肝胰腺>外套膜>闭壳肌。（3）洛克沙胂进入扇贝体内的主要途径为鳃的摄食和滤水作用，As在扇贝体内的主要富集靶点为肝胰腺、鳃和外套膜。（4）在本实验中，富集过程，As在扇贝体内的富集-转移/释放的平均周期为22 d；富集/释放过程，As在扇贝体内的富集-转移/释放的平均周期为15 d，共循环2个周期，然后扇贝As含量趋于稳定。
Abstract:The marine bivalve scallop (Chlamys farreri) was selected as the target organism, and the roxarsone exposed experiments were carried out with the nominal concentrations of 0 mg/L、0.2 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、25 mg/L.The biological accumulation and release of arsenic (As) in hepatopancreas, gill, muscle, and mantle were studied.Results showed that:(1) Both in the natural sea and the clean seawater, the sequence of As content in the four tissues was gill > hepatopancreas > mantle > muscle.(2) During the bioaccumulation, the sequence of As content in the tissues was hepatopancreas > gill > mantle > muscle.And during the release, the sequence of the As release rate was gill > hepatopancreas > mantle > muscle.(3) The main pathway for roxarsone entering C.farreri was the ingestion and filter effects of gills.And the main target tissues of As bioaccumulation in C.farreri were hepatopancreas, gill, and mantle.(4) In the present study, the average period of bioaccumulation and release of As in C.farreri was 22 days in the bioaccumulation experiments, and 15 days in the release experiments.And meanwhile, there were 2 cycles in the release experiments and then the As content in the scallops tend to be stable.
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Keywords:
- roxarsone /
- arsenic /
- Chlamys farreri /
- accumulation /
- release
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洛克沙胂(ROX)是一种在世界范围内广泛应用的畜禽有机胂饲料添加剂，具有广谱抗菌、抗球虫和明显促生长的作用，在畜禽养殖中取得了较好的经济效益[1]。洛克沙胂在动物体内吸收较少，大多以原形随畜禽粪便直接排出，成为环境中砷(As)污染的重要来源[2]。洛克沙胂被生物排出体外后经过地球生物化学循环使得地下水及邻近河流、海域中As含量升高，可能对环境中的微生物、动植物等产生生态毒性，对水生态安全及人类健康造成较大危害[3]。贝类作为近海养殖中常见的物种，由于其附着性、滤水性及重金属富集性，可以作为近海海域洛克沙胂(As)污染的指示性生物。通过检测贝类对其生活环境中洛克沙胂污染的As积累含量，可以评价近海海水中As污染程度，对近海水环境的评价有重要的指示意义。
本文研究了栉孔扇贝(Chlamys farreri)4种组织(肝胰腺、鳃、闭壳肌和外套膜)在不同洛克沙胂质量浓度暴露条件下对As的富集/释放特性，对了解洛克沙胂在栉孔扇贝体内的分布、富集、迁移以及环境As污染程度具有重要的理论指导意义，为我国栉孔扇贝的安全养殖和质量控制提供科学依据，为贝类的重金属毒性效应研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
栉孔扇贝，取自牟平扇贝养殖场，壳长(5.69±0.35) cm，壳宽(4.78±0.38) cm，实验前用养殖清洁海水驯养7 d，驯养期间没有产卵现象，死亡率 < 5%。挑选健康、反应灵敏、大小基本一致的栉孔扇贝作为试验动物。养殖清洁海水的指标测试显示：水温(12.2±0.28)℃，盐度31.17±0.27，pH 7.63±0.04，As本底质量浓度4.74×10-3 mg/L。养殖用实验水箱：水箱尺寸为0.5 m×0.5 m×0.5 m，配有充气泵和进出水管，实验前经清洗消毒处理。实验所用药品洛克沙胂为国产分析纯。
1.2 实验方法
根据我国GB11607-89《渔业水质标准》[4]中As的最高容许质量浓度(0.05 mg/L)和预实验结果，设计As的暴露质量浓度，洛克沙胂质量浓度分别为25 mg/L、5 mg/L、1 mg/L、0.2 mg/L、0 mg/L (对应As质量浓度分别为7.121 mg/L、1.424 mg/L、0.285 mg/L、0.057 mg/L、0.000 mg/L)。
富集/释放试验开始前，对自然海域中栉孔扇贝进行样品采集。选定的采样海域为山东烟台牟平海区，采集的组织样品为肝胰腺、鳃、闭壳肌、外套膜及贝类全组织，对其As含量进行测试。
试验分为富集和释放两个测试组：富集试验持续30 d；释放试验持续40 d，其中富集过程9 d，释放过程31 d。每天投喂一定量的螺旋藻粉，藻粉中砷含量均符合GB/T17243-1998《饲料用螺旋藻粉》[5]的限量要求。试验开始，养殖密度为一只栉孔扇贝/1 L养殖水，每天换水一次，定量加入洛克沙胂工作液使As含量保持在实验所需浓度，每组设3个平行，在富集试验第0 d、4 d、9 d、15 d、22 d、30 d分别从各平行水箱中随机采取3只栉孔扇贝的肝胰腺、鳃、闭壳肌和外套膜，处理后待测。释放试验中，富集阶段样品采集时间与富集试验相同，富集结束后，将扇贝转移至符合国家渔业水质标准的清洁海水中进行As释放，每天换水一次，并在释放开始的第0 d、1 d、6 d、13 d、21 d、31 d，进行样品采集，处理待测。
样品中As含量的测定参照GB/T147.3-2013《海洋监测技术规程》[6]，采用电感耦合-等离子质谱法(ICP-MS)进行测试。
1.3 数据处理
数据为3次重复的平均值，数据处理采用SPSS 17.0，进行差异显著性分析(One-way ANOVA，Tukey)，以p < 0.05表示具有统计学意义。
2 结果与讨论
2.1 富集试验中扇贝对As的富集/释放特征
重金属进入贝类体内后，会胁迫使其合成金属硫蛋白并与之结合，达到解毒的作用，但这种作用是有限的，当组织中重金属过度积累后，会向其他组织转移，再过量就会引起生理毒性[7]。本富集和释放试验过程中，均没有发生扇贝大量异常或死亡的现象，说明本试验采用的洛克沙胂(As)暴露浓度并不足以引起明显的生态毒理作用。
富集/释放试验开始前，对自然海域中栉孔扇贝生物体及4种组织中As含量进行测试。由图 1可知，自然海域栉孔扇贝不同组织的As含量存在显著差异(p < 0.05)。其中，扇贝生物体中As的平均含量分别低于鳃、肝胰腺和外套膜3种组织中各自的As平均含量，说明这3种组织是金属As进入扇贝体内后富集的主要靶点。Magda等[8]和张美琴等[7]的研究均表明，动物体不同组织对某种重金属具有高度选择性，肝、胰和肾等器官可以快速大量合成金属硫蛋白，是贝类、鱼类和甲壳类解毒和排泄的主要器官，由此也是重金属富集的重要靶器官。
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图 1 自然海域中栉孔扇贝组织及生物体中As的富集量Fig. 1 The As content in the tissues and body of C.farreri in the natural sea area富集试验开始前，栉孔扇贝各组织中As含量的排序为鳃(16.6×10-6)＞肝胰腺(15.4×10-6)＞外套膜(8.91×10-6)＞闭壳肌(3.66×10-6)，与自然海域栉孔扇贝As含量组织排序一致。由图 2可知，富集试验中，栉孔扇贝各组织对不同浓度洛克沙胂表现出明显的富集过程，不同组织对重金属富集程度存在显著差异(p < 0.05)。随着富集时间延长，各组织中As含量变化呈现各自的特征。
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图 2 富集试验中栉孔扇贝各组织对As的积累和释放Fig. 2 Accumulation and release of As in different tissues of C.farreri in the bioaccumulation experiments富集阶段初期，扇贝对As的富集量明显大于其对As的释放量，造成As在扇贝体内的快速积累，4种组织在不同的富集时间里达到As含量的第一个最高点，且在肝胰腺中最高，闭壳肌中最低(图 3)。其中，鳃达到As含量最高点的时间(4 d)早于肝胰腺(9 d)，肝胰腺早于闭壳肌(15 d)，说明As进入扇贝体内首先在鳃表面附着于其结合位点，然后在肝胰腺内结合金属硫蛋白达到富集效果，只有在鳃和肝胰腺内达到富集平衡时，才会有一部分转移到闭壳肌中[9]。外套膜的表现与其他3个组织不同，在0.2 mg/L洛克沙胂暴露试验组As含量第一个最高点出现的较晚(第22 d)，在1 mg/L、5 mg/L和25 mg/L暴露试验组分别出现在第9 d、9 d和15 d，说明扇贝摄入洛克沙胂存在另外不同的途径，即外套膜的渗透作用[10]。本实验过程中，鳃组织As的含量始终高于外套膜(图 2和图 3)，说明其摄入洛克沙胂(As)的主要途径是通过鳃的摄食和滤水作用。张石天等[11]通过对浙南沿海养殖贝类重金属含量的研究也得出一致的结论，即海洋动物富集重金属的主要途径是摄食和滤水。
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图 3 富集试验中栉孔扇贝各组织As最高富集量Fig. 3 The maximum As contents in the tissues of C.farreri in the bioaccumulation experiments图 3显示，在As含量达到最高点时，栉孔扇贝组织As含量的排序为肝胰腺＞鳃＞外套膜＞闭壳肌。其中，肝胰腺、鳃和肌肉中As含量与暴露浓度基本呈正相关，而外套膜中As含量则与暴露浓度没有明显的相关性，说明栉孔扇贝体内As的富集/释放与As暴露浓度和富集组织有关；4种组织中As富集量的排序与马元庆等[12]对海湾扇贝Cd组织富集含量排序的研究结果及王军等[13]和崔正国等[14]对虾夷扇贝Cd组织富集量排序的研究结果(内脏团>鳃>闭壳肌)基本一致，但与王凡等[15]栉孔扇贝Pb组织富集排序及崔正国等[14]虾夷扇贝对Pb的组织富集排序(鳃>内脏团>闭壳肌)不同，说明重金属在海洋贝类组织内的富集特征还与生物种类和重金属种类有关。同时，表 1中扇贝4种组织对As的平均富集倍数排序结果(肝胰腺>外套膜>肌肉>鳃)对应了不同组织在重金属摄入、解毒和排泄过程中的不同作用，例如肝胰腺的解毒作用和鳃组织的摄入作用。
表 1 富集试验中栉孔扇贝各组织As最高富集倍数Tab. 1 The maximum accumulation multiple in the tissues of C.farreri in the bioaccumulation experiments
对富集过程中栉孔扇贝4种组织中As总含量的统计结果显示(图 4)，As总含量在第9 d基本达到平衡，并在第22 d完成明显的转移/释放，其组织总As含量继续第二轮的升高，由此可推断在本实验过程中4种组织对As的富集-转移/释放的平均周期为22 d。
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图 4 富集试验中栉孔扇贝各组织As总含量Fig. 4 The total As contents in the tissues of C.farreri in the bioaccumulation experiments2.2 释放试验中扇贝对As的富集/释放特征
图 5显示，随着释放时间的延长，As含量的变化特征在肝胰腺、鳃和闭壳肌中基本是一致的，但低暴露浓度(0.2 mg/L ROX)变化特征并不明显。外套膜中As含量变化特征区别于其他3个试验选取组织，说明栉孔扇贝具有多种As释放途径，其中的释放机理有待进一步研究。4种组织中As含量平均顺序为消化腺>鳃>外套膜>闭壳肌。其中，鳃组织对As的平均释放率最高，其次为肝胰腺，最低为闭壳肌，这与肝胰腺和鳃是水生生物主要的解毒和排泄器官，而闭壳肌对重金属的排出能力较差有关[16]。
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图 5 释放试验中栉孔扇贝各组织对As的积累和释放Fig. 5 Accumulation and release of As in different tissues of C.farreri in the release experiments由图 6可知，4种组织中As总含量在第9 d富集阶段结束时达到第1个最高点，在试验进行至第15 d时基本达到第1个最低点，在第22 d时，组织As总含量达到第2个最高点，且随时间推移而下降，最终趋于稳定，此时组织As含量的排序为肝胰腺>鳃>外套膜>闭壳肌。说明洛克沙胂在4种组织中的富集-释放/转移平均周期为15 d，共循环2个周期。同时，释放趋于稳定时As总含量与本底含量基本持平，说明受重金属污染较短的栉孔扇贝，转入清洁海水释放一段时间后，仍能恢复到其本底水平。
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图 6 释放试验中栉孔扇贝四种组织As总含量Fig. 6 The total As contents in the tissues of C.farreri in the release experiments与王凡等[17]对Cu在栉孔扇贝组织中排放的研究结果相比，栉孔扇贝对As的释放率低于Cu，但其对As的释放周期(15 d)短于Cu(17 d)。张聪等[18]研究指出褶牡蛎对Cu、Cd的排出周期较长(平均约40 d)，与本试验所得结果不同，说明重金属在贝类体内的释放规律与贝类的物种和重金属种类有关。
3 结论
(1) 自然海域中和在清洁海水中驯养7 d后，栉孔扇贝4种组织中As含量排序均为鳃＞肝胰腺＞外套膜＞闭壳肌。
(2) 暴露试验中，栉孔扇贝体内As的富集/释放与As暴露浓度和组织有关。其中，肝胰腺、鳃和肌肉中As含量与暴露浓度基本呈正相关，而外套膜中As含量则与暴露浓度没有明显的相关性；富集过程中，As的组织含量排序为肝胰腺>鳃>外套膜>肌肉，释放过程中，As的组织平均释放率排序为鳃>肝胰腺>外套膜>闭壳肌。
(3) 洛克沙胂(As)进入扇贝体内的主要途径为鳃的摄食和滤水作用；As在扇贝体内的主要富集靶点为肝胰腺、鳃和外套膜。
(4) 在本实验中，当洛克沙胂持续、稳定的暴露于栉孔扇贝生活的水环境中时，As在扇贝体内的富集-转移/释放平均周期为22 d；当在洛克沙胂暴露第10 d时停止其暴露，As在扇贝体内的富集-转移/释放的平均周期为15 d，共循环2个周期，在试验进行到第30~40 d时，扇贝As含量趋于稳定。
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图 1 自然海域中栉孔扇贝组织及生物体中As的富集量
Fig. 1. The As content in the tissues and body of C.farreri in the natural sea area
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图 2 富集试验中栉孔扇贝各组织对As的积累和释放
Fig. 2. Accumulation and release of As in different tissues of C.farreri in the bioaccumulation experiments
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图 3 富集试验中栉孔扇贝各组织As最高富集量
Fig. 3. The maximum As contents in the tissues of C.farreri in the bioaccumulation experiments
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图 4 富集试验中栉孔扇贝各组织As总含量
Fig. 4. The total As contents in the tissues of C.farreri in the bioaccumulation experiments
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图 5 释放试验中栉孔扇贝各组织对As的积累和释放
Fig. 5. Accumulation and release of As in different tissues of C.farreri in the release experiments
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图 6 释放试验中栉孔扇贝四种组织As总含量
Fig. 6. The total As contents in the tissues of C.farreri in the release experiments
表 1 富集试验中栉孔扇贝各组织As最高富集倍数
Tab. 1 The maximum accumulation multiple in the tissues of C.farreri in the bioaccumulation experiments
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1. 葛淼华，周莹，张翔，吴小琼. 嘉兴市经营环节海产品中砷的形态分布与膳食暴露风险评估. 中国食品卫生杂志. 2023(10): 1468-1474 . 
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