Trace metal contents in Enteromorpha and Sargassum from South Yellow Sea, China
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摘要:
本文利用电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）测定浒苔和马尾藻中As、Cd、Cr、Cu、Mn、Pb、Zn的含量，并比较了样品对各金属的富集系数，对各金属含量进行了主成分分析。结果表明：浒苔样品中痕量金属平均含量由大到小依次为Zn > Cu ≈ Mn > As > Cr > Cd > Pb，马尾藻中依次为As > Zn > Cu > Mn > Cd > Cr > Pb。浒苔对于各金属富集系数大小顺序由大到小依次为Cu > Cr ≈ Cd > Zn > Mn > As > Pb，马尾藻为As > Cd > Cu > Zn > Cr > Pb ≈ Mn。紫菜和螺旋藻标准物质回收率为81.95%~108.75%和81.43%~109.74%，两种样品加标回收率分别为87.88%~104.76%和86.11%~112.29%，标准工作曲线线性相关系数均大于0.999。该方法具有较高的灵敏度，操作简便，适用于检测大型海藻中痕量金属的含量，结果准确。
Abstract:In this research, the contents of As, Cd, Cr, Cu, Mn, Pb and Zn in Enteromorpha and Sargassum were determined by the Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (ICP-OES).The accumulation coefficients of the metals were compared, and the principal component analysis was performed.The results indicated that the average contents of trace metals in Enteromorpha followed the order:Zn > Cu ≈ Mn > As > Cr > Cd > Pb, while in Sargassum they followed the order:As > Zn > Cu > Mn > Cd > Cr > Pb.The accumulation coefficients in Enteromorpha followed the order:Cu > Cr ≈ Cd > Zn > Mn > As > Pb, while in Sargassum they followed the order:As > Cd > Cu > Zn > Cr > Pb ≈ Mn.The recoveries of target metals in the two certified reference materials used in this research, i.e.Porphyra and Spirulina, were 81.95%~108.75% and 81.43%~109.74%, respectively; the results of spike recovery test on the two reference materials were 87.88%~104.76% and 86.11%~112.29% respectively.The linear correlation coefficients of the standard working curves were all greater than 0.999.The method has high sensitivity and is easy to operate, which is suitable for detecting the contents of trace metals in algae.
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Keywords:
- ICP-OES /
- trace metals /
- Enteromorpha /
- Sargassum /
- South Yellow Sea
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浒苔属(Enteromorpha)，隶属绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaceae)，藻体鲜绿色，细胞壁为单层细胞，围成中空管，细胞单核，片状叶绿体；马尾藻属(Sargassum)，隶属褐藻门(Phaeophyta)、墨角藻目(Fucales)、马尾藻科(Sargassaceae)，藻体黄褐色，多细胞体，大多漂浮在海面或附着在近岸岩石上。二者均广泛分布在海洋水体中，资源丰富，富含多糖、蛋白质、维生素、微量元素等，可用于食用、药用和饲料等[1-2]。
近年来，我国黄海海域连续多年发生绿潮灾害。自2007年来，以浒苔为主的绿潮暴发性的增殖、聚集、形成大规模灾害。造成海洋水体缺氧、鱼虾死亡，给生态环境带来直接和间接的经济损失。绿潮暴发期间，在南黄海海域常易于观测到马尾藻[3]。本文所获取绿藻和褐藻主要是浒苔和马尾藻。
痕量金属污染是一个重要的海洋污染类型，痕量金属可通过大陆径流、大气沉降、海水交换等进入相关海域。藻类会从海洋环境中吸收、富集痕量金属元素，其分布广泛、尺寸较大、易于获取和鉴定，常被用来作为研究海洋金属污染的有效生物。藻类一般只吸收海水中的可溶性金属，对于颗粒态的金属很难吸收，故可用于反映海洋水体中溶解性金属含量的水平[4]。本文采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)分析样品金属含量，其操作便捷、灵敏度高、可快速同时测定多种元素，符合样品中待测元素浓度范围。采用该法对浒苔和马尾藻样品中的As、Cd、Cr、Cu、Mn、Pb、Zn共7种元素含量进行了测定。
1 材料与方法
1.1 样品采集
课题组于2017年6月在南黄海海域采集到浒苔和马尾藻样品，具体采样站位如图 1所示。其中在站位NH-1、NH-2、NH-3、NH-4、NH-5、NH-10主要采集到浒苔，NH-6、NH-7、NH-8、NH-9主要采集到马尾藻。用海水清洗样品表面碎屑泥土和附着杂物，装于洁净干燥的纸质文件袋中，将封好的文件袋置于冰箱中冷冻保存。
1.2 样品处理
将海藻解冻，超纯水冲洗表面，沥干后置于洁净的玻璃培养皿上，烘箱中105℃干燥至少48 h，自然冷却后，取适量样品于玛瑙研钵中研磨，过100目筛，置于干燥器中备用。
准确称取1 g(精确至0.0001 g)干藻于聚四氟乙烯(PTFE)消解内罐中，滴加16 mL HNO3(优级纯)和4 mL HClO4(优级纯)静置过夜，将内罐置于不锈钢外套中旋紧，烘箱中90℃加热1 h，再140℃保持6 h。取出内罐，于电热板上120℃蒸发浓缩溶液至剩1 mL左右，用5% HNO3溶解并全部转移至10 mL容量瓶中，定容后摇匀待测。
为保证实验过程和结果的可信性和分析质量，选取紫菜标准物质(GBW10023)和螺旋藻标准物质(GBW10025)作为质控样品，按照上述实验步骤进行消解操作。每个站位样品和标准物质平行3次，实验全程试剂样品做空白。
1.3 检测方法
As、Cd、Cr、Cu、Mn、Pb、Zn均采用美国Perkin Elmer公司Optima 7000 DV型ICP-OES进行测定，分析波长分别为188.98 nm、226.50 nm、205.56 nm、324.75 nm、257.61 nm、220.35 nm、213.86 nm。以谱线强度(Y)为纵坐标，待测元素质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，每种待测元素相关系数r均大于0.999。
2 结果与讨论
2.1 质控样品测试结果
对紫菜标准物质(GBW10023)和螺旋藻标准物质(GBW10025)中7种痕量金属元素进行测定，测试结果及回收率见表 1。紫菜和螺旋藻标准物质所测元素的回收率分别为81.95%~108.75%和81.43%~109.74%，方法精密度(RSD)分别为1.13%~4.73%和1.66%~4.26%。两种标准物质的回收率和RSD均符合分析要求，分析结果表明该方法具有较高的可信度，可用于藻类金属元素的分析。
表 1 紫菜和螺旋藻中金属含量[×10-6(干重), n = 3]Tab. 1 The contents of metals in Porphyra and Spirulina [×10-6 (dry weight), n=3]
2.2 样品加标回收实验
为再次确保方法的准确度和精密度，选用NH-2号站浒苔样品和NH-9号站马尾藻样品进行加标回收实验，各金属加标回收实验结果见表 2。由表可见浒苔和马尾藻加标回收率分别为87.88%~104.76%和86.11%~112.29%，均符合加标回收规范，说明该方法回收率高，测定结果准确，稳定性好。
表 2 回收率测定[×10-6(干重)，n = 3]Tab. 2 The determination of recovery [×10-6 (dry weight), n=3]
2.3 浒苔和马尾藻样品中金属含量
浒苔和马尾藻中As、Cd、Cr、Cu、Mn、Pb和Zn 7种痕量金属元素的含量见表 3与图 2。浒苔和马尾藻样品中金属含量的测定结果表明同一金属在浒苔和马尾藻中的含量不同，而同一藻中不同金属含量也存在较大差异。
表 3 浒苔和马尾藻中金属含量[×10-6(干重), n=3]Tab. 3 The contents of metals in Enteromorpha and Sargassum [×10-6 (dry weight), n=3]
(1) As在两者中含量差异较大，浒苔中含量平均值仅为5.69×10-6，而在马尾藻中高达110.79×10-6；Zn元素在两种样品中的含量都较高，分别为45.84×10-6和34.04×10-6；Mn、Cu两种元素在浒苔和马尾藻中的含量接近，Mn的平均含量分别为14.69×10-6和7.69×10-6，Cu的含量分别为16.02×10-6和9.53×10-6；Cd、Cr的平均含量都较低，Cd在浒苔和马尾藻中的平均值为0.77×10-6和3.45×10-6，而Cr为3.65×10-6和1.06×10-6；Pb在两种样品中含量均最低，仅分别为0.30×10-6和0.70×10-6。
(2) 对于浒苔样品，Zn的含量最高，其含量范围为30.13×10-6~62.47×10-6；其次是Cu和Mn的含量，分别为11.61×10-6~25.50×10-6和9.59×10-6~19.67×10-6；As、Cr的含量分别为3.64×10-6~8.91×10-6、2.24×10-6~5.86×10-6；Cd、Pb含量最低，分别为0.27×10-6~1.42×10-6、0.11×10-6~0.84×10-6。浒苔中7种元素的平均含量顺序为Zn > Cu ≈ Mn > As > Cr > Cd > Pb，Zn含量的平均值约为Pb的153倍。对于马尾藻样品，As含量最高，其含量范围为83.75×10-6~136.50×10-6；其次为Zn，含量为19.91×10-6~52.75×10-6；Cu和Mn的含量分别为5.51×10-6~15.48×10-6和4.31×10-6~10.40×10-6；Cd的含量为2.82×10-6~4.13×10-6，Cr、Pb含量最低，分别为0.76×10-6~1.43×10-6和0.27×10-6~1.24×10-6。马尾藻中7种痕量金属元素的平均含量顺序为As > Zn > Cu > Mn > Cd > Cr > Pb，As含量的平均值约为Pb的158倍。
对世界不同海域浒苔和马尾藻中痕量金属含量进行比较，结果见表 4。其中，杨承虎等[5]对南麂列岛大型海藻研究表明，缘管浒苔中含量较高的元素为Mn、Zn、As、Cu，铜藻中金属元素含量高低顺序为As > Zn > Mn > Cu > Cr ≈ Cd，与本文结果基本一致。刘加飞等[6]在湛江近岸研究结果显示，马尾藻中含量较高的元素为As、Mn、Zn、Cu等，与本文研究结果基本一致。由此可见，浒苔和马尾藻对营养型元素(如Zn、Mn、Cu等)的吸收量比毒性元素(如Cr、Pb等)大得多，这些营养型元素与植物生命活动密切相关。对于马尾藻中As含量较高的原因，Farias等[7]研究发现，由于马尾藻等褐藻特殊的生物化学结构，藻体可以从海水中吸收大量As形成类似磷酸盐的砷酸盐，并转化为其他无机砷或有机砷化合物。白研等[8]结果显示，铜藻中总砷和无机砷含量均比浒苔高近100倍。林艳等[9]发现，单一离子对藻类未表现出明显生理毒性，而当Cr3+、Pb2+、Cd2+等离子共存时，则明显响应较高水平生理毒性。目前我国标准对于藻类及其制品中食用安全性评价中金属元素仅限于对Pb、As等元素的规定，《GB19643-2005藻类制品卫生标准》[10]规定，Pb的含量≤1×10-6，As(无机砷)的含量≤1.5×10-6；本文测试结果表明，样品中Pb的含量符合藻类制品食用标准。As的毒性与其形态相关，As(Ⅲ)的毒性远大于As(V)和有机砷，本文测试结果主要是总砷，故不用于评价食品中As的安全性。
表 4 与其它海域痕量金属含量的比较[×10-6(干重)]Tab. 4 The comparison of trace metal contents with other sea area [×10-6 (dry weight)]
NH-10号站位浒苔中各元素的含量均在中上水平，可能原因是其靠近海洋活动频繁的海州湾。范留邦等[11]研究发现，该海域水体中Cu、Pb超出海水标准的第四类，近岸沉积物痕量金属基本呈轻度—中等污染。沿岸入海径流，如临洪河，是海州湾最大的污水排放流，2016年临洪河携带入海重金属污染物达149 t[12]。NH-7号站马尾藻中各金属含量也较高，可能原因是其靠近江苏近岸盐城市，沿岸还分布着众多人工水库和沿海滩涂，工农业污水排放较多[13]。
藻中金属含量未表现出明显的空间分布规律，可能原因是受海面风和海流等作用。陆荣洋等[17]研究发现，2015年5月苏北近岸最早出现浒苔条带，随风场流场作用可向北漂移至日照、青岛附近，东进至江苏东部海域，故本文采集的浒苔极大可能不是产自对应站位，但所有站位综合结果仍对本海域环境状况具有指示意义。另外，Davis等[18]发现，不同类型藻类从环境中吸收金属能力不同的主要原因是细胞壁上的官能团不同，如褐藻，其细胞壁上特殊的藻朊酸盐官能团结构，较其他藻类吸收金属的能力更强，因此采集到马尾藻的4个站位(NH-6、NH-7、NH-8、NH-9)金属含量的整体水平都较高。
2.4 浒苔和马尾藻中各痕量金属富集系数
取海水密度为1.025 g/cm3，参考贺志鹏等[19]、李劳钰[20]、杨承虎等[5]对水体痕量金属含量测定结果，得As、Cd、Cr、Cu、Mn、Pb、Zn浓度分别为2.27×10-9、7.61×10-11、3.41×10-10、1.38×10-9、3.95×10-9、3.61×10-10、6.06×10-9。以藻中各金属含量与海水中对应金属含量比值表示富集系数，结果见表 5。在浒苔和马尾藻两种样品中，痕量金属的富集系数在几百倍到几万倍之间：(1)在浒苔样品中，Cu的富集系数最高，其平均值达到11607，而Pb的富集系数最小，仅为836，浒苔对于各金属富集系数大小顺序为Cu > Cr ≈ Cd > Zn > Mn > As > Pb。(2)在马尾藻样品中，As的富集系数高达48805，而Mn、Pb的富集系数最小，均约为1950。马尾藻对各金属富集系数大小顺序为As > Cd > Cu > Zn > Cr > Pb ≈ Mn，可见马尾藻对于As、Cd的富集系数要远远大于其他元素，皆在4万倍以上，而对于Pb、Mn的富集较少。
表 5 浒苔和马尾藻中金属富集系数Tab. 5 Average accumulation coefficient of heavy mental in Enteromorpha and Sargassum
2.5 主成分分析
对浒苔和马尾藻中各金属含量进行主成分分析(principal component analysis, PCA)计算，根据特征方差累计贡献率确定主成分个数，结果见图 3。浒苔中前3个主成分累计贡献率为92.09%，可以基本反映全部数据情况。第一主成分(PC1)解释总方差的46.21%，该因子变量主要在Cd、Pb、Cu上有较高正载荷(>0.82)，该组主成分可能与浒苔生命活动必须的重金属有关；第二主成分(PC2)贡献率为31.39%，Zn的正载荷为0.56，而与As表现出反相关，其负载荷为-0.94，表明第二组分可能不利于浒苔对As的富集；第三主成分(PC3)贡献率为14.49%，与其相关的Zn的正载荷为0.82，表明第三组分可能与浒苔对Zn的吸收有关。马尾藻中前2个主成分累计贡献率为93.15%，可以基本反映全部数据的情况。第一主成分(PC1)贡献率为71.85%，除Pb外，其他6种元素均有较满意的因子载荷量(>0.78)，该组主成分可能支配着马尾藻的新陈代谢；第二主成分(PC2)贡献率为21.30%，Pb的正载荷为0.91，Pb与其他元素的差异，表明第二组分可能与Pb的来源有关。
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图 3 浒苔和马尾藻中金属含量二维因子载荷Fig. 3 Factor loadings of metal concentrations in Enteromorpha and Sargassum3 结论
(1) 对于某一特定金属，其在不同藻类中的含量不同，As在马尾藻中的含量明显高于浒苔，Zn的含量在两种藻类中均较高，Mn、Cu在两种藻类中的含量接近，Cd、Cr含量较低，Pb的含量最低。同一藻类中不同金属的含量也存在较大差异，浒苔中痕量金属平均含量大小顺序依次为Zn > Cu ≈ Mn > As > Cr > Cd > Pb，马尾藻中由大到小依次为As > Zn > Cu > Mn > Cd > Cr > Pb。
(2) 两种藻类样品中痕量金属元素的富集系数在几百倍到几万倍之间。富集系数最高的是马尾藻对As的富集，平均值为48805，最小的是浒苔对Pb的富集，仅为836。浒苔对于各痕量金属元素富集系数大小顺序由大到小依次为Cu > Cr ≈ Cd > Zn > Mn > As > Pb，马尾藻为As > Cd > Cu > Zn > Cr > Pb ≈ Mn。
(3) 标准物质与样品加标回收实验回收率皆符合回收规范。该方法操作简便，灵敏度高，检出限低，实验结果具有较高准确性，可快速有效检测大型海藻中痕量金属的含量。
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图 3 浒苔和马尾藻中金属含量二维因子载荷
Fig. 3. Factor loadings of metal concentrations in Enteromorpha and Sargassum
表 1 紫菜和螺旋藻中金属含量[×10-6(干重), n = 3]
Tab. 1 The contents of metals in Porphyra and Spirulina [×10-6 (dry weight), n=3]
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表 3 浒苔和马尾藻中金属含量[×10-6(干重), n=3]
Tab. 3 The contents of metals in Enteromorpha and Sargassum [×10-6 (dry weight), n=3]
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表 4 与其它海域痕量金属含量的比较[×10-6(干重)]
Tab. 4 The comparison of trace metal contents with other sea area [×10-6 (dry weight)]
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表 5 浒苔和马尾藻中金属富集系数
Tab. 5 Average accumulation coefficient of heavy mental in Enteromorpha and Sargassum
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