海水溶解有机质的碳储量约为700 Pg (10¹⁵ g)，是海洋中最大的有机碳库，与大气圈的碳储量相当(~750 Pg C)，因此海洋DOM生产和消耗过程的变化必然会影响海洋与大气之间的碳平衡，进而影响海洋生态系统功能^[1]。前人利用加速器质谱仪(AMS)对海洋放射性碳同位素(¹⁴C)进行了分析，结果显示在水深超过1000 m的深海，海水DOM的¹⁴C年龄在4000~6000 a之间，远大于同水层的溶解无机碳(dissolved inorganic carbon； < 2300 a)和颗粒有机碳(particulate organic carbon；现代年龄)的¹⁴C年龄^[2-3]，这说明海水DOM具有比海水DIC和POC更长的滞留时间。由此焦念志等提出增加海洋惰性DOM含量是提高海洋固碳能力，缓解全球变暖的重要途径^[4]。DOM在海洋生物地球化学循环中也扮演着至关重要的角色，它是海洋异养生物的食物和营养来源，其中有色溶解有机质(chromophoric DOM, CDOM)能够吸收对生物有害的紫外辐射，影响海水水质^[5]。DOM还能对海水pH起到调节和缓冲作用，与海水中的金属离子和污染物相结合，影响它们在海洋中的迁移转化、毒性和生物可利用性^[6]。因此，DOM的研究一直是生态学，生物地球化学，环境学等领域关注的热点。

2015年，Kellerman等发现DOM的环境持久性与其分子特征密切相关，因此要全面评估DOM的环境行为，就必须对其化学组成有深入的了解^[7]。水体DOM主要来源于生物残骸和分泌物，包括碳水化合物、腐殖质、蛋白质、氨基酸和有机酸等，这些有机物在环境中经过光降解和生物降解等作用会变得更加复杂。常用于分析DOM化学特性的方法包括元素分析法^[8](如总有机碳，氮的含量分析)和光谱分析法^[9](如紫外-可见光谱，三维荧光光谱)，前者提供了元素含量的信息，后者则提供DOM中光敏成分如CDOM和FDOM(fluorescent DOM)的含量、组成及来源等信息。随着现代分析技术的发展，高分辨率质谱仪和核磁共振谱仪能够提供更加精细、甚至是分子水平上的结构信息^[10-11]，这使得开展深层次的DOM研究成为可能。与陆地水体DOM的研究相比，开展海水DOM的研究具有更大的挑战：首先，海水含有大量的盐分，海水DOM与盐度的质量比值约为1: 17500，如此高浓度的盐分阻碍了高分辨率质谱和核磁谱对海水DOM的直接测量；其次，海水溶解有机碳的浓度很低，如深海海水的有机碳含量仅为~40 ppm^[12]，而这还包含数以千计、不同类型的化合物^[13]。因此在开展海水DOM的化学分析前，常常需要对样品进行预处理，以达到浓缩有机质和脱盐的目的。近年来，固相萃取^[13-14](solid-phase extraction; SPE)、超滤^{[1, 15]}(ultrafiltration; UF)和反渗透电渗析^[16-17](reverse osmosis/electr dialysis; RO/ED)技术得到了迅猛发展。由于分离和富集处理是开展海水DOM化学成分(特别是分子结构)分析的前提，因此全面评估这些分离富集方法就显得非常重要。

前人从分离技术的基本原理、步骤以及应用等方面总结了DOM的分离富集方法^[18-19]，但相关工作均发表于10多年前，在这之后DOM的富集技术和仪器分析技术得到了长足的发展，例如改性苯乙烯-二乙烯苯聚物(PPL)在天然水体的DOM富集中得到了广泛应用。与传统C18固定相比，PPL具有更高的富集效率，而且样品歧视性更小^[13]；此外，超高分辨率的傅里叶变换离子回旋共振质谱(fourier transform ion cyclotron resonance-mass spectrometry，FT-ICR MS)越来越多地应用在DOM的分子组成解析中，大大促进了我们对海水DOM的认识^[13]。基于这些考虑，本文在前人总结的基础上，重点探讨近10 a来新发展的海水DOM分离富集技术，并对未来这一领域的发展做简单的展望。

1   固相萃取技术

1.1   固相萃取的原理

固相萃取(SPE)是从液-液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)发展起来的一种富集方法^[20]，在上世纪70年代就已经用于腐殖质的分离富集^[21]，目前仍然是最常用的水样前处理方法^{[14, 22]}。固相萃取与液相色谱的原理类似，可以近似看作一个简单的色谱过程，该方法对DOM的富集是基于有机化合物与固体填料之间的吸附作用进行的。根据被萃取组分与吸附剂作用力的强弱不同将DOM分离成不同组分，达到样品分离、富集、提取三位一体的过程^{[5, 23]}(图 1)。SPE会根据萃取剂的化学特性，选择性富集某些组分(如疏水性化合物)，因此经SPE萃取后的DOM并不能完全代表原始的DOM特征^[24-25]。

图  1  PPL固相萃取示意图^{[13, 23]}

Fig.  1  Scheme of PPL solid phase extraction (SPE)^{[13, 23]}

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1.2   不同萃取相的富集特点

1.2.1   XAD树脂的吸附分离

早期用于DOM提取的SPE吸附剂主要是XAD-1、2、4、7、8等XAD树脂^{[21, 26]}，它们是一类非离子大孔径吸附剂，利用XAD树脂可将富集有机物分为腐殖质和非腐殖质两种。尽管XAD树脂可将DOM分成亲水性酸、碱、中性物质和疏水性酸、碱、中性物质等多种组分，但XAD树脂富集海水DOM的回收率只有5%~15%^[27-28]，而且会频繁使用到酸碱溶剂，易导致DOM性质和结构的破坏。此外，XAD树脂富集DOM的操作非常繁琐费时，通常处理一个样品的时间需要5~120 h^[29]。

1.2.2   C18和PPL的吸附分离

键合硅胶型C18吸附剂是疏水性的，一般用于非极性组分和低分子量DOM的提取^[30]，而PPL是改性苯乙烯-二乙烯苯聚物，可以同时保留极性和非极性化合物。这种差异使得PPL具有较高的DOM回收率(>60%)和重现性，因此被认为是一种理想的DOM吸附剂^{[13, 23]}。

2000年，Louchouarn等^[29]通过C18-SPE分离富集淡水，河口和海水DOM，回收效率分别为42%，(32±0.3)%和(22±1.1)%。这表明从淡水系统到开阔大洋，随着盐度上升，水体DOM的回收率是逐渐下降的。2005年，Koch等^[31]对不同深度的海水DOM进行了C18-SPE富集实验，发现回收率没有显著变化((24±6)%)。由于从海水表层到深层，DOM的化学结构和¹⁴C年龄有明显变化，但海水盐度基本保持恒定，这说明盐度是影响C18-SPE提取效率的重要因素。2008年，Dittmar等^[13]运用C18和PPL吸附剂提取了来自巴西北部陆架，具有不同程度海陆混合的DOM样品，系统比较了这两种吸附剂的富集差异。结果显示，PPL具有更高的DOM回收效率，平均值为62%，而且基本不受到DOM浓度和水体盐度变化的影响。相比而言，C18对DOM的富集效率大约为PPL富集效率的2/3(~40%；图 2)。因此，在利用SPE富集海水DOM时，PPL要明显优于C18。

图  2  不同吸附剂对河口近海DOM的提取效率^[13]

Fig.  2  Extraction efficiency of estuarine and continental DOM from different absorption reagents^[13]

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前人对富集后的DOM进行元素组成和同位素分析后发现，PPL-DOM的C/N比值(21±1)相对于C18-DOM(37±2)偏低，说明前者更容易富集有机氮组分；此外，PPL-DOM的δ¹³C值(-24.8‰)，与C18-DOM的δ¹³C值(-23.4‰)相比略微偏负，说明PPL对陆源有机质组分具有更强的选择性，但来自核磁(¹H-NMR)的结果显示，两种吸附剂富集的DOM组分具有很大的相似性^{[5, 13]}。2008年，Sleighter等^[11]沿着河流到切萨皮克湾采集了河水、沼泽水和近海海水，对DOM的分析结果显示C18更倾向于吸附高H/C组分，但会损失部分高含氧的极性化合物(如丹宁和肽类等)。2014年，陈美莲等^[32]研究了藻类和落叶的渗滤液、表层海水、萨旺尼河河水(Suwannee River)以及诺迪克保留地湖水(Nordic Reservoir)，紫外吸收数据表明，SPE-PPL富集的DOM比原始样品芳香性降低，体积排阻色谱表明富集后的DOM中高聚合物(多糖、类蛋白、氨基酸类)损失较多，表明用PPL对DOM进行富集的过程中，倾向富集低芳香性小分子量的有机质。

2   膜分离技术

2.1   膜分离技术原理

膜分离技术是基于有机质的物理性质，利用不同孔径大小的膜和膜渗透性的差异来实现DOM的分离。该技术具有处理量大、分离过程不需要添加化学试剂等特点，因此采用膜分离技术基本不会改变DOM的化学结构。目前常用的膜分离手段有超滤(UF)和反渗透电渗析(RO/ED)两种。

2.2   超滤

2.2.1   超滤的原理

超滤(UF)是一种介于纳滤与微滤之间的膜分离技术，其原理是利用物理筛分作用和不同孔径的超滤膜，将DOM根据分子量大小分成不同的组分，如截留分子量为0.5，1，3，5，10，30，100 kDa等。

由于海水中含有大量的胶体有机物，它们的存在会影响DOM在超滤膜上的截留量并造成吸附损失，进而影响DOM的回收率。此外，盐度和浓缩系数也会对超滤的回收率造成影响。因此在海水样品完成超滤分离富集后，还需添加一定体积的超纯水再次进行渗滤，以去除绝大部分的无机盐^[5]。常用的UF类型有两种：搅拌式超滤^[33]和切向流超滤^[15]，搅拌式超滤通常适用于小体积水样的DOM分离富集，而切向流超滤在处理大体积样品(> 10 L)。在超滤过程中，渗透液中DOC的浓度和截留液中胶体有机碳(COC)的百分比随着浓缩因子而变化，因此浓缩倍数一般选取在10~30之间^[33]。

2.2.2   超滤方法的富集特点

超滤分离富集对于不同分子量的DOM具有一定的选择性，一般来说超滤的回收率随着DOM分子量的增加而上升。1992年，Benner等^[15]运用UF技术富集了3个不同深度的北太平洋海水DOM，发现UF对大洋海水DOM的回收效率为22%~ 23%，并且回收率随着海水深度的增加而降低，这可能与深海海水DOM含有更多的小分子化合物有关。因此通过UF富集得到的DOM也不能完全代表原始样品的特征。

Benner等^[34]随后又研究了墨西哥湾海水的DOM，UF的富集结果显示从河水到墨西哥湾，DOM回收率从49%降低到22%，后者接近于早期对北太平洋海水DOM超滤的回收效率。该结果说明UF的富集效率会随着海水盐度的增加而降低，因此和C18-SPE一样，在利用UF富集海水DOM时，也必须考虑盐度的影响(图 3)。2005年，Simjouw等^[33]报道了对河口近海的DOM研究结果，发现UF能有效保留分子量大的多糖及其降解产物以及氨基糖类化合物。为了验证盐度对DOM的影响，Kruger等^[35]通过人工添加无机盐的方法来改变河口水样的盐度，该方式排除了DOM自身化学差异对富集效率的影响。结果表明DOM回收率随着盐度的增加而降低；对富集的DOM开展紫外可见光谱分析后发现，富集后的DOM与原始样品相比具有非常接近E2/E3值(即样品在250 nm和365 nm处的紫外吸收值之比)，但是对于不同浓度的DOM样品，UF的回收效率明显不同。研究显示UF对淡水样品的DOM富集效率约为(66±24)%，而对海水样品的DOM回收效率仅为(25±8)%^{[5, 36]}。

图  3  UF-DOC回收率与不同样品盐度的关系^[35]

(AC:Amity Creek-苏必利尔湖溪流；Br2:Brule River 2-布鲁河；Ls165:Lake Superior 165 meter deep, 苏必利尔湖165 m深)

Fig.  3  Relationship between UF-DOC recovery and different salinity^[35]

(AC:Amity Creek; Br2:Brule River 2; Ls165:Lake Superior 165 meter deep)

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由于UF只能富集大于截留分子量的化合物，并且对海水DOM的回收效率较低，这些因素限制了UF的广泛应用。需要指出的是，尽管UF富集海水DOM受到盐度、样品浓度和超滤膜种类等多种因素的影响，但它仍然是一种值得推荐的分离富集方法，特别是在处理大体积样品方面的能力是其他方法所不及的。

2.3   反渗透电渗析

2.3.1   原理

反渗透电渗析是近十年来迅速发展的一种DOM富集方法。考虑到单独使用反渗透系统(RO)在富集海水DOM时盐分也得到富集，Koprivnjak等^[16]在2006年提出将RO和电渗析(ED)结合，以达到同时富集海水DOM和除盐的效果。简单来说，RO/ED技术首先是在RO系统中利用压差完成膜分离，并在外部压力下将样品分成渗透相(主要成分为水和部分中性分子)和富集相(包括极性离子和DOM)；随后ED系统在外加电场作用下，对富集的DOM溶液进行除盐处理(图 4)。ED理论上可以去除绝大部分阴、阳离子(如Na⁺、K⁺、Ca²⁺，Cl^-、NO^3-、等)，同时RO能够对DOM进行高效的富集，这使得RO/ED耦合系统在富集海水DOM中表现出极大的优势。研究结果显示，RO/ED法可以有效地对海水除盐，使得海水DOM与海盐的质量比从1: 17500提高到1: 180，经富集后的DOM溶液基本满足了核磁共振(NMR)和傅里叶离子回旋共振质谱(FT-ICR MS)分析的要求^{[5, 37]}。需要注意的是，在操作过程中，RO/ED系统必须使用严格的0.01 M NaOH(pH 12)冲洗系统以除去RO膜上的有机物质。

图  4  RO/ED系统原理图^[17]

Fig.  4  RO/ED system schematic diagram^[17]

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2.3.2   反渗透电渗析方法的富集特点

2007年，Vetter等^[37]发现RO/ED对海水DOM的回收率超过60%。Gurtler等^[17]富集了9个不同海水的DOM，结果也表明RO/ED对海水DOM的回收率在61%~95%之间。2009年，Koprivnjak等^[16]运用RO/ED法富集了16个海水样品，光谱和元素分析的结果表明通过RO/ED富集的DOM与原始海水样品相比具有非常相似的紫外-可见光谱(UV-vis)和C/N比值。考虑到RO/ED法对海水DOM的回收效率可达70%~85%，是UF和SPE回收效率的2~3倍，因此可以认为通过RO/ED法得到的DOM更能代表原始的海水特征。此外，来自核磁共振(¹³C-NMR和¹H-NMR)的结果显示，RO/ED富集的DOM中含有相对较低的碳水化合物和较高的烷基碳化合物，并且同时含有高分子和低分子量的DOM，这与UF法对DOM分子量的固有歧视性明显不同。

2014年，Chen等^[38]运用FT-ICR MS分析北太平洋和北大西洋不同深度的海水DOM后发现，经RO/ED富集的DOM与原始DOM相比有54%~79%的分子式是相同的，该发现再次证明了经RO/ED富集的DOM比UF和SPE更能代表初始样品的性质。2014年，Green等^[39]对表层和深层海水DOM进行富集分离发现，RO/ED的回收效率分别为(63±4)%和(68±2)%，而且该方法对海水DOM的回收效率基本不受深度的影响。Zhang等^[40]运用¹³C-NMR分析了珠江口的DOM，发现经RO/ED富集的DOM含有较高比例的烷基碳(20.1%~45.1%)，而且对淡水DOM回收率达到30%~107%，但是随着浓缩倍数的增大，回收效率显著降低。因此，为了保证DOM回收效率不低于80%，RO/ED的浓缩倍数一般不能超过60。

3   不同分离富集方法的比较

3.1   富集效率

富集水体(特别是海水)样品中的DOM是获取高质量的质谱和核磁分析的前提，如何确保分离富集过程能够最大程度的保留原始样品的信息一直是DOM研究的热点和难点。作为最普遍运用的分离富集方法，SPE，UF和RO/ED方法各有其优缺点，以下从富集效率和样品保守性两个方面展开比较。

与SPE和RO/ED相比，UF的主要优势是无需添加可能改变或降解DOM的化学物质(表 1)，而且可以将DOM分成分子量不同的组分，但是UF对海水DOM的回收效率很低(不到1/3)，并且对实验流程和设备要求比SPE高。RO/ED具有最高的海水DOM回收效率(>70%)，因此在海水DOM富集方面具有更大的潜力，但是目前RO/ED需要更严格的操作条件(如需要保证恒定的pH)，而且在设备价格和运行成本方面远远超过了SPE和UF。由于使用了膜分离技术，RO/ED和UF都会由于样品在膜上的滞留而逐渐降低DOM回收效率，也不能完全去除海水DOM中的无机盐，所得样品杂质较多。与RO/ED和UF相比，SPE在富集海水DOM方面具有明显的化学歧视(更倾向于富集疏水性物质)，但SPE得到的海水DOM纯度较高，灰分低，且具有操作简单快速，运行成本低的特点，而且基于PPL的SPE回收效率基本不受水深和盐度等环境因子的影响，因此特别适用于小体积海水的DOM富集。

表  1  不同提取方法对海水DOM的回收率对比^[41]

Tab.  1  Comparison of recovery efficiency for marine DOM among different extraction methods^[41]

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3.2   样品保守性

样品信息的保守性也是评价DOM富集方法优劣的重要指标。严格来说，目前并没有一种理想的DOM富集方法能够完全不具有化学歧视。Broek等^[45]结合SPE和UF对表层和深层海水进行富集对比，发现UF比SPE的富集效率更低，但是UF比SPE富集的DOM的C/N性质与原始海水有较好的一致性。对于经SPE和UF富集的表层海水DOM，其δ¹³C值比原始海水表现出明显的负偏，而深层海水则差别很小。另外，SPE在表层和深层海水中富集的DOM比原始海水的¹⁴C年龄老200~300 a，而UF富集的DOM与原始样品年代差异极大，表层富集DOM比原始海水年轻近1700 a，而深层富集的DOM年代比原始海水年轻近2500 a，这可能是因为UF主要是富集的¹⁴C年龄较小的大分子化合物。经过SPE富集的海水DOM在C/N值上略高于原始水样，并倾向于富集惰性DOM，而经UF富集的海水DOM，虽然在C/N值上与原始海水接近，但是富集效率低，并优先富集年轻的碳组分，导致了δ¹³C和¹⁴C年龄与原样的显著偏离。

海水DOM在不同富集方式的影响下，化学组成呈现出一定的差异。对于深层海水，UF和RO/ED富集的DOM化学组成相似；而对于太平洋表层海水样品，经UF富集后的DOM含有更高比例的烷氧碳比例，而烷基碳比例则减少，表明UF优先富集高分子量的碳水化物类物质^{[26, 46-47]}。FT-ICR MS提供的分子组成特征表明SPE会损失高O/C比率(>0.7)的丹宁类，木质素类/多羧基的脂环族物质，高H/C(>1.5)的脂肪族化合物，以及杂环类化合物^[14]。目前对RO/ED富集海水的化学保守性报道的较少，但考虑到该方法对海水DOM的高回收率，经RO/ED富集的DOM应该比SPE和UF更能代表原始海水的特征。此外，SPE富集海水DOM过程中需要使用甲醇作为洗脱剂，这是否会引起甲醇与含羧酸基团化合物的酯化反应还有待于进一步评估。

4   展望

对海水DOM选择合适的前处理方法除了需要考虑较高的回收率，较好地重现性外，前处理过程是否会对样品产生污染，是否会改变样品原有的物理化学性质也是评价富集方法优劣的重要指标。尽管海水DOM富集方法在过去十年取得了很大的进展，但都还存在各自的局限性。SPE和UF常常会选择性地富集不同组分的DOM，因此在实际研究中要根据具体的实验目的选择合适的富集方法。RO/ED系统具有最高的海水DOM回收效率，其富集产物能最好的代表原始样品的DOM性质，而且其运营成本和操作时间随着科技的发展有可能进一步降低，从而最终成为最有效的海水DOM富集方法。另外，将不同的分离富集方法串联使用也是最近发展的新趋势，如利用UF将海水DOM根据分子量大小分成不同的组分，然后利用SPE的吸附原理将不同组分进行富集。总之，每种富集方法都各具特点，至于实际的研究中选择何种富集方法还需要根据研究目的、样品性质和实验室条件进行选择。