随着我国沿海地区的发展，赤潮等海洋灾害发生的频率越来越高^[1]。大量含有氮磷等营养物质的工业污水排放入海是引发赤潮的主要原因。水体中的氮磷浓度增高会造成赤潮生物的大量繁殖，当生物量达到一定程度时会导致赤潮的发生，进一步会引发赤潮发生区域海水pH的变化^[2]。一般认为，海水pH的变动很小，并且表层海水的pH为8.2 ^[3]。海水pH受很多因素的影响，比如径流、大气交换、降雨、氧化还原等物理化学作用，但是海洋浮游植物的光合作用、呼吸作用也会影响海水pH的变化^[4]。海水中溶解性无机碳的种类及浓度的不同会影响浮游植物的生长速率，进而造成pH的变化^[5]。海水中CO₂的变化也会引起海水pH的变化^[6]。海水pH的急剧上升会造成海水无机碳形态的改变，尤其是CO₂的浓度将大幅下降^[7]。浮游藻类进行光合作用时会吸收海水中的无机碳，从而导致周围水域的pH升高^[8-9]。

中肋骨条藻、赤潮异弯藻以及塔玛亚历山大藻都是常见的赤潮藻类，分别属于硅藻门、着色鞭毛藻和甲藻门。我国许多海域也都发生过由这几种赤潮藻引发的赤潮，其中中肋骨条藻是东海及南海的主要赤潮藻种，赤潮异弯藻是黄海的主要赤潮藻种，塔玛亚历山大藻也是中国近海典型的赤潮藻种^[10]。中肋骨条藻藻细胞直径为6~22 μm，形状是透镜形或圆柱形；赤潮异弯藻藻细胞具两条不等长的鞭毛，形状呈椭圆形，为单细胞，长约8~25 μm，宽约6~15 μm；塔玛亚历山大藻藻细胞是球形，长略大于宽，细胞长20~42 μm，宽18~40 μm，可产生麻痹性贝毒^[11]，因此经常会爆发有毒赤潮。

近岸赤潮的爆发通常都会出现海水pH上升的现象^[12-14]，本研究在封闭的条件下培养3种不同赤潮藻中肋骨条藻、赤潮异弯藻以及塔玛亚历山大藻，避免了空气中的CO₂进入到培养体系中，分别是正常营养盐组、缺氮营养盐组和缺磷营养盐组，以模拟赤潮爆发高峰时期藻类生长碳源受限的环境，研究在CO₂不足的情况下赤潮藻类生长过程不同阶段pH的变化规律。希望可以为预报和治理赤潮及缓解海洋酸化提供一些参考数据。

1   材料与方法

1.1   实验藻种及培养

本实验所用中肋骨条藻、赤潮异弯藻和塔玛亚历山大藻均由国家海洋环境监测中心提供。

培养方法：海水取自于大连黑石礁附近海域，经过滤灭菌后使用，加入Conway营养液和维生素，接入藻种，在MGC-450BP型恒温光照培养箱中培养，光照度3000 lx，温度20±0.1℃, 光暗周期12 h: 12 h, 每天摇动培养瓶4次，防止藻细胞附壁或下沉^[10]。

1.2   pH的测定

采用pH计测定pH。

1.3   仪器和设备

数据型笔试pH-℃测量仪：HI98127。

1.4   数据处理

用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析处理，不同藻种生物量和pH比较、不同营养条件各生长时期差异性比较采用单因素方差分析方法，生长过程pH与生物量、磷酸盐浓度相关性分析采用皮尔逊相关性分析法，差异显著性设置为P＜0.05；Excel作图。

1.5   实验方法

培养适量中肋骨条藻、赤潮异弯藻和塔玛亚历山大藻，每种藻液各培养3组，一组加入正常的Conway营养液和维生素，一组加入缺氮营养盐和维生素，一组加入缺磷营养盐和维生素，至初始浓度达到10⁵/mL后，将3组藻液各适量分装到20个容积为500mL的具塞锥形瓶中，将塞子扭紧后再用封口膜进行密封以确保在实验过程中没有CO₂进入到锥形瓶中，形成一个藻类生长碳源不足的生长环境。实验持续20 d，每天在同一时间取出适量藻液测定生物量和藻液pH，进行3组平行实验。

2   结果与讨论

2.1   赤潮藻类的生长情况

中肋骨条藻在3种营养条件下的生长状况于图 1，通过计算藻细胞生长的比生长率(表 1)可以得出前8 d藻细胞处于指数生长期，之后进入稳定生长期。正常营养盐条件下的中肋骨条藻生长的比缺氮和缺磷营养条件下的要快一点，其最大生物量为(2.77±0.20)×10⁶/mL，而缺氮和缺磷培养下的最大生物量分别为(2.49±0.30)×10⁶/mL和(2.32±0.28)×10⁶/mL。指数生长期第2 d、3 d缺氮组的生物量高于正常组的，之后正常组的生物量逐渐增加。

图  1  三种培养条件下中肋骨条藻的生长曲线图

Fig.  1  The growth curve of S.costatum under three culture conditions

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表  1  赤潮藻种不同营养条件比生长速率计算

Tab.  1  Growth rate of different red tides algae in different nutritional conditions

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赤潮异弯藻在3种营养条件下的生长状况于图 2，通过计算藻细胞生长的比生长率(表 1)可以得出前8 d藻细胞处于指数生长期，之后进入稳定生长期，在生长第10 d生物量开始出现了下降的现象，之后到实验结束又处于一个稳定的状态。正常营养盐条件下的赤潮异弯藻的生长并没有明显地比缺氮和缺磷营养条件下的快，其最大生物量为(1.55±0.21)×10⁶/mL，而缺氮和缺磷培养下的最大生物量分别为(1.36±0.24)×10⁶/mL和(1.35±0.24)×10⁶/mL。

图  2  三种培养条件下赤潮异弯藻的生长曲线图

Fig.  2  The growth curve of H.akashiwo under three culture conditions

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塔玛亚历山大藻在3种营养条件下的生长状况于图 3，通过计算藻细胞生长的比生长率(表 1)可以得出塔玛亚历山大藻指数期比较长，前12 d藻细胞处于指数生长期，生物量在逐渐增加，相比中肋骨条藻和赤潮异弯藻增长速度要慢许多，之后进入稳定期，实验后期开始出现藻细胞死亡的现象，生物量出现下降，但依旧是正常培养条件下的生物量最大，为(0.20±0.01)×10⁶/mL，缺磷培养条件下的生物量最少，最大生物量为(0.14±0.03)×10⁶/mL，下降得最快，缺氮培养条件下的最大生物量为(0.18±0.03)×10⁶/mL。

图  3  三种培养条件下塔玛亚历山大藻的生长曲线图

Fig.  3  The growth curve of A.tamareme under three culture conditions

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一般认为在营养不足的情况下藻类的生长会受到影响，但汪芳^[15]等研究发现，在氮浓度较低的情况下，单种培养的中肋骨条藻的平均生长速率与氮浓度高时相差不大，本实验结论与其有相同之处。由于本实验所使用的赤潮藻种也有中肋骨条藻，因此实验前预测也应该大致出现相同的情况，但实验结果却表明中肋骨条藻在正常和氮限制的条件下生长速度没有明显的差别，这可能是因为本实验是在封闭的条件下进行的，大气中的CO₂无法进入培养体系内，外界空气中的CO₂不会与培养藻类的海水进行交换，这已经让藻细胞的生长缺少了足够的碳源，因此在生长所需的碳源不足的情况下，藻细胞的生长受到了影响，且这一因素的影响程度远远超过了藻液中硝酸盐对其生长的影响，所以在两种培养条件下中肋骨条藻的生长差别不大。

赤潮异弯藻的生长情况与中肋骨条藻不同，赤潮异弯藻在第10 d出现生物量下降的情况可能是因为其藻细胞比较大，在CO₂不足的情况下部分藻细胞死亡，之后藻细胞数量减小到一定数量后又适应了生长环境，处于稳定。在第10 d、11 d、12 d藻细胞数量下降的这几天, 正常培养条件下的生物量要高于缺磷培养，缺氮培养下的生物量最低，这说明氮磷充足弥补了碳源不足对藻细胞生长的影响，使得藻细胞仍然可以生长，并且凋亡的数量减少，缺磷培养比缺氮培养下的生物量多说明磷元素相对于氮元素对赤潮异弯藻的生长更重要。

与中肋骨条藻和赤潮异弯藻在指数期迅速生长不同，塔玛亚历山大藻在指数期的生长较缓慢许多，这可能是由于培养的初始浓度较小，藻细胞间的竞争小，藻细胞生长相对不受限制，仍能缓慢生长直至进入稳定期后，环境资源出现不足，造成藻细胞数量一定程度的下降，尤其是在缺磷的条件下，细胞数量大幅下降，说明磷元素对塔玛亚历山大藻的生长很重要，对于细胞结构的组成不可或缺。

本实验赤潮藻细胞在3种营养条件下的生长没有显著性的差别(表 2)，这是因为本实验赤潮藻类的生长是处于一个封闭的环境中，外界空气中的CO₂不会与培养藻类的海水进行交换，因此在生长所需的碳源不足的情况下，藻细胞的生长受到了影响，生长速度比碳源充足的情况要慢。

表  2  不同营养条件对同一藻种各生长时期影响的方差分析

Tab.  2  Variance analysis of different red tides algae in different nutritional conditions

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2.2   赤潮藻类生长过程中pH的变化情况

中肋骨条藻、赤潮异弯藻的pH变化情况见图 4和图 5。中肋骨条藻和赤潮异弯藻在藻类生长处于指数生长期时，藻液pH急剧增加，在指数期第4 d达到最大值，之后当藻细胞生长进入稳定期时，藻液的pH也处于稳定，虽然也在上升但增加幅度较小，大致稳定在同一水平，并且正常营养缺氮营养盐和缺磷营养盐3种培养条件下的pH变化趋势基本相同。中肋骨条藻在正常组、缺氮组和缺磷组pH的变化范围分别是：8.3~9.7、8.2~9.7和8.4~9.8；赤潮异弯藻在正常组、缺氮组和缺磷组pH的变化范围分别是：7.9~9.2、8.1~9.2和8.2~9.2。

图  4  三种培养条件下中肋骨条藻的pH变化曲线

Fig.  4  Variance of pH during growth of S.costatum under three culture conditions

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图  5  三种培养条件下赤潮异弯藻的pH变化曲线

Fig.  5  Variance of pH during growth of H.akashiwo under three culture conditions

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塔玛亚历山大藻的pH变化情况见图 6。塔玛亚历山大藻生长时也经历了指数期和稳定期，但是藻液pH的变化趋势与中肋骨条藻和赤潮异弯藻的变化趋势不同，藻液pH一直在上升，直到实验后期15 d开始上升幅度变小，处于稳定，缺磷组pH最高，缺氮组其次，正常组的最低。塔玛亚历山大藻在正常组、缺氮组和缺磷组pH的变化范围分别是：8.2~9.8、8.2~9.8和8.2~10.0。

图  6  三种培养条件下塔玛亚历山大藻的pH变化曲线

Fig.  6  Variance of pH during growth of A.tamareme under three culture conditions

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当pH＞8.35时，水溶液中没有CO₂存在。本实验中肋骨条藻正常、缺氮组从第2 d，缺磷组从第1 d开始；赤潮异弯藻正常、缺氮、缺磷组从第2 d开始；塔玛亚历山大藻正常组从第5 d，缺氮、缺磷组从第4 d开始时pH已经大于8.35，说明此时水溶液中已经不含有CO₂，在水气界面交换时没有CO₂交换到水体中，由于实验培养的微藻是在具塞锥形瓶中培养的，并且用封口膜加以密封，因此锥形瓶内的CO₂含量并不会增加，可以证明实验条件是在CO₂不足的条件下进行的。

海洋中的赤潮藻类作为初级生产者利用海水中的无机碳源进行光合作用。无机碳源通常以CO₂(aq)、H₂CO₃、HCO₃^-和CO₃^2-这4种形式存在于海水中，处于动态平衡中^[16]。赤潮爆发时，浮游植物大量繁殖，表层海水中的无机碳浓度会由于浮游植物的光合固碳作用而下降^[17-18]。李晓琳^[19]实验发现中肋骨条藻和塔玛亚历山大藻从培养开始经过指数期、稳定期至实验结束，藻液的pH分别从7.6和7.7增加至最大8.2，分别增加了0.6和0.5，而本实验这两种赤潮藻在正常培养下分别增加了1.4和1.6，缺氮培养下分别增加了1.5和1.6，缺磷培养下分别增加了1.4和1.0，赤潮异弯藻在正常、缺氮和缺磷培养下pH也分别增加了1.2、1.1和1.0。这是因为本实验与李晓琳的实验相比外界空气中的CO₂无法进入到培养体系中，赤潮藻类在生长过程中所需的碳源不足，对CO₂的吸收加快，导致H⁺的浓度大幅下降，pH也相应的大幅上升。庄万金^[20]等研究了1987年厦门西海域赤潮发生时海水pH的时空变化，发现赤潮爆发时pH也随之急速上升至全年最高值，pH增加了0.38，浮游植物开始衰亡时pH也随之急速下降，这与本实验的pH变化规律相吻合，并且本实验最大达到了1.8。前者发现海水pH与浮游植物的生物量有着相当好的相关性，这与浮游植物光合与动物的呼吸协同作用有关。霍文毅^[17]等对1998年胶州湾由中肋骨条藻引发的赤潮进行了研究，发现赤潮过程中pH由7.85上升到8.45上升了0.6。

本实验过程中没有添加其他任何碳源，因此赤潮藻类在生长过程中所利用碳源是溶解于培养液表层海水中的CO₂，所以培养液的pH是受此碳酸盐体系的调控影响的。水中溶解态无机碳的平衡关系式为：

由于本实验的培养环境不与空气相通，近似于封闭，大气中的CO₂无法进入到培养体系中与海水进行交换，因此赤潮藻类的生长是处于一个碳源不足的环境，再加之随着藻类的生长，藻类为了满足自身生长的需求会吸收利用海水中的CO₂，当CO₂缺乏时会吸收HCO₃^-，HCO₃^-在碳酸酐酶等一系列酶的作用下转化为CO₂以进行光合作用。所以，在上述生理活动中，会造成海水中CO₂的含量下降，从而导致平衡关系式左移，H⁺的浓度减少，最终海水的pH逐渐增大。浮游植物光合作用消耗CO₂时，海水的pH将升高；呼吸作用和有机物分解释放CO₂时，pH将下降。当浮游植物光合作用使CO₂的消耗量远大于呼吸作用和有机物降解产生的CO₂量时，海水的pH将明显升高^[21]。赤潮发展时期由于拥有高生物量，浮游植物大量繁殖时同化海水中的CO₂，水体的pH大幅升高，达到8.64，甚至9.59^[22-24]。浮游植物处于衰亡期时，光合作用减弱，同时浮游植物的死亡及有机质分解，释放大量的CO₂，pH也会降低^[20]。pH升高的同时水体CO₂浓度会降低，并且远低于平衡的CO₂水平，CO₃^2-将成为水中的无机碳形式，而这一形式的无机碳是藻细胞生长不可利用的，因此藻细胞的竞争性也会降低^[25]。由于微藻的光合固碳作用消耗的CO₂经常会超过水体中溶解的CO₂浓度，因此即使在大气CO₂不断升高的情况下海水pH也会升高。光合固碳的速度越快，pH升高的也越快^[26]。

中肋骨条藻、赤潮异弯藻生长前8 d, 以及塔玛亚历山大藻生长前12 d属于指数生长期，在这期间藻细胞的数量会爆发式的增长，藻细胞大量吸收CO₂，平衡关系式会加速左移，H⁺浓度急剧下降，造成pH也在以指数形式大幅增加；当藻类生长从第9 d及第13 d开始进入稳定期后，藻细胞数量大致稳定，对CO₂的需求相对于指数期减少很多但仍有消耗，平衡仍然会左移，H⁺浓度也在减少，pH也会有小幅增加，但最终会稳定于一个值左右，因此可以大概预测pH与细胞数量之间存在正相关，而通过对3种赤潮藻在各营养条件下pH与生物量进行相关性分析得出(表 3)：pH与生物量确实存在显著性正相关。

表  3  不同藻种生长过程pH与生物量、磷酸盐浓度相关性分析

Tab.  3  Correlative analysis of pH and biomass and PO₄-P of different red tides algae in different nutritional conditions

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2.3   赤潮藻类生长过程中培养液中磷酸盐浓度的变化情况

中肋骨条藻、赤潮异弯藻和塔玛亚历山大藻培养液中PO₄-P浓度的变化如图 7~图 9。在3种赤潮藻生长的指数期培养液中PO₄-P浓度急剧下降，直至生长进入稳定期后浓度趋于稳定。3种赤潮藻在缺磷组藻液中PO₄-P浓度明显低于另2组，塔玛亚历山大藻在第13 d左右PO₄-P的含量低于检测限以下。藻细胞进行光合作用时需要吸收P作为营养元素，在指数期时生长速率快，PO₄-P的浓度在此时急剧下降。除此之外藻细胞需要大量吸收CO₂，导致海水中CO₂减少，而HCO₃^-和CO₃^2-的含量增加，最终pH升高^[27]。培养液中PO₄-P的浓度与pH的变化存在一定的相关性。3种赤潮藻中肋骨条藻、赤潮异弯藻和塔玛亚历山大藻在3种营养条件下培养液中PO₄-P的浓度与pH均存在显著性负相关(表 3)。

图  7  三种培养条件下中肋骨条藻培养液中磷酸盐浓度的变化情况

Fig.  7  Variance of PO₄-P in culture solution under three culture conditions by S.costatum

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图  8  三种培养条件下赤潮异弯藻培养液中磷酸盐浓度的变化情况

Fig.  8  Variance of PO₄-P in culture solution under three culture conditions by H.akashiwo

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图  9  三种培养条件下塔玛亚历山大藻培养液中磷酸盐浓度的变化情况

Fig.  9  Variance of PO₄-P in culture solution under three culture conditions by A.tamareme

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2.4   方差和相关性分析

对3种赤潮藻不同营养条件各生长时期的生物量进行方差分析，结果见表 2。由表 2可知，在正常、缺氮和缺磷3种营养盐培养下，中肋骨条藻、赤潮异弯藻和塔玛亚历山大藻在指数期和稳定期的生物量没有明显的差异性。

对3种赤潮藻各营养条件下pH与生物量、PO₄-P进行相关性分析，结果见表 3。由表 3可知，在正常、缺氮和缺磷3种营养盐培养下，中肋骨条藻、赤潮异弯藻和塔玛亚历山大藻pH与生物量均存在显著性正相关，与PO₄-P浓度均存在显著性负相关。

对3种赤潮藻生长过程的pH进行方差分析，结果见表 4。由表 4可知，在正常和缺磷营养盐培养条件下，3种赤潮藻中肋骨条藻、赤潮异弯藻和塔玛亚历山大藻在生长过程中pH均存在显著性差异。在缺氮营养盐培养条件下，第1 d 3种赤潮藻pH无显著性差异，其后生长过程中pH均存在显著性差异。

表  4  同种营养条件不同赤潮藻种间pH变化的方差分析

Tab.  4  Variance analysis of pH of different red tides algae

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3   结论

(1) 赤潮藻在碳源不足的生长环境下，藻液pH增加量比碳源正常环境下高；

(2) 3种赤潮藻生长过程中藻液pH与生物量之间存在显著性正相关；与PO₄-P浓度之间存在显著性负相关；

(3) 在正常和缺磷营养盐培养条件下，3种赤潮藻生长过程中pH均存在显著性差异，在缺氮营养盐培养条件下，第1 d 3种赤潮藻pH无显著性差异，其后生长过程中pH均存在显著性差异；

(4) 中肋骨条藻在正常、缺氮和缺磷3种营养盐培养下pH分别增加了1.4、1.5和1.4；塔玛亚历山大藻在正常、缺氮和缺磷3种营养盐培养下pH分别增加了1.6、1.6和1.8；赤潮异弯藻在正常、缺氮和缺磷3种营养盐培养下pH分别增加了1.2、1.1和1.0。