诺氟沙星是氟喹诺酮类抗菌药，具广谱抗菌作用，是治疗肠炎痢疾及泌尿系感染的常用药，在人畜医用及水产养殖中广泛使用，通过生活、生产废水直接排放到河流，进入海洋环境中；诺氟沙星在海水养殖中也经常使用，是近海常见新型有机污染物。虽然抗生素的排放量不大且沉淀降解较快，但由于不断地被排放，所以经常以动态平衡的形式存在于环境中，是拟持久性有机污染物，对海洋生物生长造成潜在的影响^[1]。有研究表明，诺氟沙星在河水中广泛分布，且浓度较高(99~120 mg/L)；在海水中同样广泛分布，但浓度较河水有所降低(31~62 mg/L)^[2]，可能对海洋生态系统产生不利影响。

小球藻广泛分布于海水中，其生长速度极快，而且其蛋白质含量高，经常用于给轮虫等多细胞动物甚至是鲫鱼等鱼类当作饵料^[3]。盐生杜氏藻是唯一能在高盐度环境下生存的藻类^[4]，由于其细胞中胡萝卜素含量可达细胞干重的14%^[5-7]，因此它已成为商业化生产天然胡萝卜素的最好藻种。另外，盐生杜氏藻在保健品的制作用也有广泛应用。新月菱形藻为菱形藻科、菱形藻属，暖温性、咸水种或半咸水种藻类植物，分布于世界各海水、半咸淡水水域，我国各海区均有出现。有研究指出，新月菱形藻富含EPA^[8]，其对老年性病如老年痴呆，老年斑也有治疗作用，另外，对婴儿生长发育，调节血管阻力和伤口愈合上有很重要作用^[9]，是多种软体动物、甲壳类幼体和浮游动物(如轮虫)的主要食源^[10-12]。这三种海藻近海海水中均有分布，是常见海水养殖饵料藻，可能受到诺氟沙星的不利影响。从目前文献资料来看，诺氟沙星的研究大多局限在医学领域^[13-14]，仅有少量文献涉及其对大型溞、淡水鱼、淡水藻、海月水母等的毒性研究^[15-23]。不仅缺乏诺氟沙星在海洋环境中的非效应浓度的相关报道，诺氟沙星对海洋微藻毒性效应的研究资料也很匮乏。因此研究诺氟沙星对盐生杜氏藻、新月菱形藻和小球藻等常见海水养殖饵料藻的生态毒性作用，对于近海生态系统保护有一定意义。

1   材料与方法

1.1   实验材料

盐生杜氏藻、新月菱形藻和小球藻均由中国海洋大学提供，并在南京信息工程大学海洋科学学院保存，实验前进行多次扩大培养。

海水取自盐城近海，盐度为29，先用0.45 μm的微孔滤膜过滤，再在高压灭菌锅中在125℃条件下灭菌15 min。

诺氟沙星从上海阿拉丁生化科技股份有限公司购买，其分子式为C₁₆H₁₈FN₃O₃，在-20℃的超低温保种箱中保存，配置母液前从超低温保种箱中取出并在常温下放置2 h后用于溶解。首先配置成0.5 g/L的母液于用HCl调至pH为3的海水中，并保存于密封不透光处。正式实验时稀释至实验浓度，并用NaOH调至pH等于8。

1.2   培养条件

诺氟沙星浓度设置如表 1。其中盐生杜氏藻不设置处理组4和处理组5，这是因为盐生杜氏藻粒径较大，容易破坏海水中诺氟沙星过饱和时的平衡，导致实验后期海水中诺氟沙星的有效浓度会急剧降低。每个浓度设置两个平行样。

表  1  诺氟沙星实验浓度设置(mg/L)

Tab.  1  Concentration of norfloxacin experimental setup(mg/L)

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实验微藻以过滤海水添加营养盐和微量元素(f/2配方^[24])作为培养液，添加诺氟沙星污染物后置于250 mL锥形瓶中，在光照培养箱中培养。培养温度22℃，盐度29，pH 8.0，光照强度60 μmol/(m²s)，初始密度盐生杜氏藻为1.3×10⁴ /mL、新月菱形藻为9.3×10⁴ /mL、小球藻5.2×10⁴ /mL，光周期12 L: 12 D。污染物浓度间隔设置见表 1。每组设置2个平行样。每隔24 h取5 mL培养液，在650 nm波长下测定其OD值，根据预实验测定的微藻OD-密度关系，计算微藻密度。实验对象种群出现衰亡时结束实验。

1.3   数据分析方法

1.3.1   微藻生长过程的拟合

在诸多浮游植物生长模型中，Logistic模型因其拟合效果好，生物学意义明确而被广泛应用。Logistic模型具体形式如下：

式中：参数B_f为浮游植物终止生物量；B₀为浮游植物初始生物量；B_t为t时刻下的浮游植物生物量，单位均为10³ /mL；r为浮游植物的种群增长率，单位为1/d；t为培养时间，单位为d。

Logistic生长模型的参数B_f是通过对整个生长过程的拟合而得到，表征了环境能够容纳的浮游植物种群的最大生物量，是由环境资源和压力所决定的种群限度^[25]，涵盖了浮游植物种群的整个生长过程。另外，Logistic生长模型表明，B_f是与浮游植物起始状态无关的状态参数；实验结果也证实，同一种浮游植物在相同的培养条件下，B_f基本相同，不受接种量及生理状态的影响^[26]。实验结果与理论分析都表明，在浮游植物生态实验中，B_f作为指标比72 h平均细胞密度和相对生长率具有更高的灵敏性和可靠性^[27]。因此，本实验采用终止生物量B_f作为诺氟沙星毒性效应计算的指标。

1.3.2   抑制率的计算

定义浓度为c的诺氟沙星的抑制率^[28]为

式中：B_f(c)表示任意污染物浓度下的浮游植物终止生物量；B_f(0)表示对照(无污染物)条件下浮游植物终止生物量，单位均为10³/ mL。

1.3.3   效应浓度EC₂₀和EC₀₅的计算

NOEC(no-observed-effect concentration)常被用来作为污染物安全暴露基准浓度。由于NOEC只是一个实验设计浓度，不能构造置信区间，经济合作与发展组织推荐应用EC₀₅替代NOEC，作为生态安全暴露基准浓度^[29]。EC₀₅是指与对照实验相比，能使效应指标(如生物量、生长率等)减少5%的污染物浓度，可基于剂量—效应关系推算。EC₂₀是指与对照实验相比，能使效应指标(如生物量、生长率等)减少20%的污染物浓度，通常作为污染物已经对生物造成显著性影响的浓度^[30-31]。由于污染物浓度与生态受体之间的剂量—效应曲线通常呈现反“S”形，可应用log-logistic模型^[32-33]拟合这类曲线并估算EC₀₅和EC₂₀值。log-logistic模型方程如下：

式中：参数B_f(c)为任意污染物浓度下的浮游植物终止生物量；B_f(0)为对照(无污染物)条件下浮游植物终止生物量；单位均为10³ /mL；x为浮游植物毒性效应值，单位为mg/L；b为曲线形状参数。Logistic生长模型曲线，EC₂₀和EC₀₅均采用OriginPro 8进行拟合和计算。

1.3.4   预测非效应浓度PNEC的计算方法

欧盟水质基准是世界主流水质体系之一，通过物种敏感度分布(species sensitivity distribution, SSD)推导预测非效应浓度(predicted no effect concentration, PNEC), 最终确定水质基准^[34]。SSD假定有限的物种是从生态系统中随机抽取的，能够代表整个生态系。该方法要用8种不同的生物、至少10个污染物毒性数据来构造敏感度分布曲线，曲线上指定百分点处所对应的浓度值，通常用5%物种受到危险的浓度，作为环境PNEC值^[35]。通过文献搜集诺氟沙星非效应浓度，构造诺氟沙星SSD，利用Excel软件中pecentile函数计算SSD百分位数为5时的浓度值，作为诺氟沙星对海洋生态系统的PNEC。

2   结果与讨论

2.1   诺氟沙星对藻类生长的影响

2.1.1   诺氟沙星对盐生杜氏藻生长的影响

实验浓度范围内(表 1)，盐生杜氏藻生物量都随时间增加而增大，符合Logistic生长模型。不同浓度条件下的诺氟沙星对盐生杜氏藻有较为显著的影响(图 1)。空白对照组的B_f值为36.38×10⁴/mL，在1 mg/L的浓度下，盐生杜氏藻的B_f值与对照组没有显著性差别(α>0.05)，在10 mg/L的浓度时，B_f值迅速减小，B_f仅为28.42×10⁴ /mL，抑制率达28.0%，而随着浓度的进一步增加，B_f值变化减缓，在20 mg/L时B_f为27.32×10⁴ /mL，抑制率增加幅度趋缓，抑制率为33.2%(图 2)。

图  1  不同浓度诺氟沙星对盐生杜氏藻生长的影响

Fig.  1  Effect of different concentrations of norfloxacin on the growth of Dunaliella salina

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图  2  不同海藻的抑制率随浓度的变化

Fig.  2  Different microalgaes inhibition rate along with the change of concentration

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2.1.2   诺氟沙星对新月菱形藻生长的影响

实验浓度范围内(表 1)，新月菱形藻生物量也都随时间增加而增大，符合Logistic生长模型，但B_f值随浓度的增加呈现出先增加后减小的趋势(图 3)。空白对照组的B_f值为200.3×10⁴/mL，在1 mg/L的浓度下，新月菱形藻的B_f值略高于对照组，为216.7×10⁴/mL，这可能与毒性兴奋效应有关，但二者并没有明显的显著性差异(α>0.05)。随着浓度的升高，B_f值迅速减小，但当浓度达到20 mg/L时，B_f值变化也减缓，B_f值在160×10⁴ /mL左右，诺氟沙星的抑制率变化同样趋于缓和，在60 mg/L时达33.4%(图 2)。

图  3  不同浓度诺氟沙星对新月菱形藻生长的影响

Fig.  3  Effect of different concentrations of norfloxacin on the growth of Nitzschia closterium f.minutissima

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2.1.3   诺氟沙星对小球藻生长的影响

实验浓度范围内(表 1)，小球藻生物量也都随时间增加而增大，符合Logistic生长模型，B_f值随浓度增加而减小(图 4)，且诺氟沙星对小球藻的影响在三种微藻中最为显著。在1 mg/L时，小球藻的B_f值相对对照组已经明显减小，其B_f值仅为375.1×10⁴ /mL，抑制率已经达到11.9%(图 2)，可见诺氟沙星对于小球藻的毒性是很高的。随着浓度的升高，B_f值继续减小，同样地，当浓度达到20 mg/L时，B_f值变化也减缓，在300×10⁴/mL左右，诺氟沙星的抑制率变化趋缓，并且明显高于其他两种微藻，在60 mg/L时已达43.0%。

图  4  不同浓度诺氟沙星对小球藻生长的影响

Fig.  4  Effect of different concentrations of norfloxacin on the growth of Chlorella vulgaris

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另外，从图 4中可以看出，当浓度为1 mg/L时，小球藻在7 d时已经进入稳定期，而当浓度大于10 mg/L时，小球藻在6 d时已经几乎停止生长，进入稳定期，特别是当浓度为60 mg/L时，小球藻在5 d时就已经进入稳定期，可见随着诺氟沙星浓度的增大，小球藻的指数增长期有明显缩短的趋势。

2.2   EC₂₀和EC₀₅

应用log-logistic模型对三种微藻不同浓度下的B_f值进行拟合，分别得到了污染物诺氟沙星对三种微藻的EC₂₀和EC₀₅，如表 2所示。污染物诺氟沙星对新月菱形藻的毒性效应最低，EC₂₀和EC₀₅分别为25.36 mg/L和1.76 mg/L；对盐生杜氏藻的毒性效应较低，EC₂₀和EC₀₅分别为10.54 mg/L和1.25 mg/L；对小球藻的毒性效应最低，EC₂₀和EC₀₅分别为5.33 mg/L和0.01 mg/L。

表  2  不同海藻的EC₂₀和EC₀₅

Tab.  2  EC₂₀ and EC₀₅ of different

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三种海藻的EC₂₀均在EC₀₅的10倍以上，特别是小球藻可达到50倍，可见它对于诺氟沙星是非常敏感的。总体来看，诺氟沙星对这三种海洋微藻的抑制率随浓度变化趋缓。

图  5  EC₂₀和EC₀₅

Fig.  5  EC₂₀ and EC₀₅

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2.3   环境预测非效应浓度

目前我国仍未建立诺氟沙星污染物的水质基准，但其在水体中分布的广泛性和其对水生生物的毒性却都是不容小觑的^[36]。海域的环境因素不同，生物敏感性差异也较大，我国海水水质基准应主要选择我国本土生物作为保护目标，基于充分的科学数据，通过科学的推导方法来获得。本文结果可为我国诺氟沙星水质基准的建立提供依据。

不同生物的污染物毒性效应顺序差异很大，使得同一生物在污染物敏感性分布中常处于不同等级。分析表明，在诺氟沙星的敏感性分布中，小球藻为敏感性物种(% Rank＜0.10)；盐生杜氏藻、新月菱形藻为较敏感性物种(0.10≤ % Rank＜0.35)(图 6)^[37]。

图  6  诺氟沙星污染物物种敏感性分布

Fig.  6  Sensitivity distribution of norfloxacin pollutants

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根据本文实验结果，结合文献数据，构造诺氟沙星污染物物种敏感性分布(图 6)，计算其PNEC为0.096 mg/L。

3   结论

(1) 诺氟沙星对盐生杜氏藻的EC₂₀和EC₀₅分别为10.54 mg/L和1.25 mg/L；诺氟沙星对新月菱形藻的EC₂₀和EC₀₅分别为25.36 mg/L和1.76 mg/L；诺氟沙星对小球藻的EC₂₀和EC₀₅分别为5.33 mg/L和0.01 mg/L。

(2) 基于物种敏感性分布得到海洋生态系统诺氟沙星污染物PNEC为0.096 mg/L。