Study on the growth and cellular polyphosphates of Chaetoceros curvisetus under different phosphate conditions
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摘要:
本研究分析了不同磷酸盐培养条件下旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)不同生长阶段的生长情况以及藻细胞内多聚磷酸盐(polyphosphate,PolyP)的变化特征。结果表明:在高磷培养条件下,旋链角毛藻最高细胞密度可达4.99×109 cell/L,细胞核PolyP和短链PolyP在起始期显著高于指数生长期,细胞核长链PolyP在起始期显著高于指数生长期和维持期(P<0.05);在低磷培养条件下,旋链角毛藻最高细胞密度为9.35×107 cell/L,藻类细胞质长链PolyP在指数生长期显著高于维持期。无论是高磷还是低磷培养条件下,旋链角毛藻细胞总PolyP都与藻细胞密度呈显著负相关性(P<0.05)。另外,在高磷培养条件下旋链角毛藻细胞密度与细胞核长、短链PolyP呈显著负相关性,而在低磷培养条件下旋链角毛藻细胞密度与细胞质、细胞核长链PolyP呈显著负相关性。本研究结果可为阐明旋链角毛藻赤潮生消过程中磷酸盐的储存利用机制提供一种新的思路。
Abstract:Chaetoceros curvisetus is an important bloom-forming species in China. In this study, the growth characteristics of C. curvisetus at different growth phases and the changes of polyphosphate (PolyP) in algal cells at different phosphate concentrations were analyzed. It was found that under the condition of high phosphorus culture, the maximum cell density of C. curvisetus was 4.99×109 cell/L, and the nuclear PolyP and short-chain PolyP in the initial phase were significantly higher than those in the growth phase, and the nuclear long-chain PolyP in the initial phase was significantly higher than those in the growth phase and maintenance phase (P<0.05). Under the condition of low phosphorus culture, the maximum cell density of C. curvisetus was 9.35×107 cell/L, the long-chain PolyP in the cytoplasm of C. curvisetus in the growth phase was significantly higher than that in the maintenance phase. Whether under high or low phosphorus cultivation conditions, the total PolyP in the cells of C. curvisetus was negatively correlated with the cell density (P<0.05). In addition, the cell density of C. curvisetus was negatively correlated with the long-chain and short-chain PolyP in the nucleus under high phosphorus culture conditions, while it was negatively correlated with the long-chain PolyP in the cytoplasm and nucleus under low phosphorus culture conditions. The results of this study can provide a new theoretical basis for clarifying the storage and utilization mechanism of phosphate during the bloom of C. curvisetus.
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Keywords:
- Chaetoceros curvisetus /
- polyphosphate /
- growth phase /
- cell density
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旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)隶属硅藻门盒型藻目角毛藻科,细胞较小,细胞壁较薄,广泛分布于我国东海、黄海和渤海等海域。该藻在我国曾引发过多次赤潮,导致自然界和水产养殖中鱼类大量死亡[1]。目前,有关研究主要集中在相关环境因子对旋链角毛藻生长的影响以及其分泌的化感物质对其他藻类的影响[2-3],对于旋链角毛藻赤潮的生消机理研究还不够深入。众所周知,磷是影响海洋藻类生长和赤潮生消的关键因素之一,往往以无机磷酸盐的形式被藻类吸收[4],而磷酸盐被藻类吸收后常以多聚磷酸盐(polyphosphate,PolyP)的形式存在。金文育等[5]研究指出,环境磷变化会对赤潮原因种米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)胞内PolyP产生较大的影响。因此,对赤潮高发区海水磷变化与赤潮生消之间关系的研究十分必要,尤其是藻类细胞内PolyP的作用机制研究。
PolyP是一种由三至数千个磷酸盐残基通过高能磷酸键连接而成的线性聚合物[6-9],一直被称作古老的能源,微生物生长发育所需的物质如氨基酸、脂肪和糖类等都由这些能量合成[10]。有研究表明细胞往往以PolyP的形式在体内储存磷酸盐[11-12],因此PolyP是细胞内的能量储库和ATP的来源[13]。近年来,有关细胞PolyP的研究主要集中在酵母(Saccharomyces cerevisiae)[14]等模式生物中,而对藻类细胞内PolyP研究较少。目前,对藻类方面的研究主要是PolyP在细胞中的分布,比如在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的液泡和细胞壁上发现了PolyP[15-17];四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)叶绿体、细胞质和细胞壁中也存在PolyP [18];甚至嗜酸衣藻(C. acidophila)细胞表面也有额外的PolyP[19]。另外,也有研究发现单细胞红藻在面对环境磷变化时,会降解或合成PolyP,在磷酸盐胁迫条件下,液泡中长链PolyP(Long chain PolyP,LC-PolyP)在酶的作用下分解为短链PolyP(Short chain PolyP,SC-PolyP)以维持细胞生长;当磷酸盐充足时,细胞会合成长链PolyP并将其转运到液泡中储存起来[20]。但是,在海洋中分布极广的硅藻生物中相关研究却不多[5,21],所以硅藻细胞PolyP分布特征与硅藻生消过程非常值得研究。
本研究从旋链角毛藻细胞PolyP对不同磷环境的动态响应出发,着重阐述了在面对不同磷环境时,旋链角毛藻在不同生长阶段的藻密度变化、细胞质和细胞核PolyP的分布情况以及细胞质和细胞核长短链PolyP的分布情况,期望了解旋链角毛藻对PolyP的储存与利用方式在硅藻生消过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 藻种来源与培养条件
本实验旋链角毛藻(GY-H28)购自上海光语生物科技有限公司,用f/2培养基进行培养,培养基所用人工海水盐度为30,海水经滤膜(孔径为0.45 μm)进行过滤,然后在121 ℃灭菌锅中灭菌20 min。藻类培养条件如下:温度为20 ℃±1 ℃、光照强度为40 μmol/(m2·s)、光暗比为12 h∶12 h。每天早晚各手动摇藻一次。
1.2 实验方法
1.2.1 实验设计
旋链角毛藻的初始密度为2.0×107 cell/L,设置两个实验组:高磷组(NaH2PO4终浓度约为36 μM)和低磷组(NaH2PO4终浓度约为0.1 μM),每组设置3个平行,高磷组分别在第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天取样,每次取样藻类数量至少为1.2×109个细胞。鉴于低磷组藻类生物量较少,为了满足实验取样细胞生物量(1.2×109个细胞),低磷组分别在第0、6、12、18、24、30天进行取样。取样之后检测藻细胞密度变化和细胞内PolyP分布情况。
1.2.2 藻细胞计数
取0.9 mL藻液,用0.1 mL卢戈氏液将细胞固定,在光学显微镜下用0.1 mL浮游植物计数框计数。
1.2.3 细胞质核分离
本实验藻类细胞质核分离采用植物细胞核和细胞质提取试剂盒(BB-361124-100T,上海贝博生物科技有限公司),按照说明书进行操作。程序如下:将藻液离心,弃上清液,在沉淀中加入500 μL提取液A,在超声波清洗器(KQ-50DA,昆山市超声仪器有限公司)中超声20 min,然后在4 ℃下振荡30 min,之后离心(800 g,5 min),将上清液和沉淀分离,上清液为细胞质、沉淀为细胞核,在沉淀中加入500 μL Tris-buffer缓冲液(20 mM),混匀。细胞总PolyP含量即细胞质和细胞核PolyP之和。
1.2.4 LC-PolyP和SC-PolyP分离
藻液离心(10000 g,5 min),弃上清液,在沉淀中加入0.3 mL三氯乙酸[2%(w∶v)]将PolyP水解10 min;离心(15000 g,4 min),在沉淀中加入1 mL三氯乙酸−丙酮溶液[0.7%(w∶v):67%(v∶v)];离心(15000 g,4 min),在沉淀中加入0.5 mL丙酮溶液[67%(v∶v)]洗涤;用等体积混合的平衡酚−三氯甲烷萃取丙酮,得到SC-PolyP含量[22]。另外,细胞质或细胞核PolyP含量与细胞质或细胞核SC-PolyP含量之差为LC-PolyP含量。
1.2.5 PolyP含量检测
采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)荧光染色定量法[23]:藻液经过离心、超声、100 ℃水浴、酶解(同时加入DNA酶、RNA酶和蛋白酶K)等处理,再加入DAPI染色,之后用荧光分光光度计(HITACHI,日立F-2700FL)在Ex:415 nm,Em:550 nm条件下检测PolyP含量。
1.3 数据分析
所有实验数据均以平均值 ± 标准差(SD)表示,鉴于本实验数据呈非正态分布(Shapiro-Wilk法),各处理组间数据差异采用非参数检验,即高磷和低磷培养组数据之间的差异性采用Mann-Whitney U检验,不同生长阶段数据之间的差异性使用Kruskal-Wallis检验和Dunn-Bonferroni多重比较。藻类细胞密度与多种类型PolyP采用Spearman方法开展相关性分析,P<0.05表示统计学分析上差异显著。另外,所有数据统计分析采用SPSS19.0,相关图表制作采用Origin 2022,相关系数矩阵图用Matlab软件制作。
2 结果与讨论
2.1 不同磷酸盐培养条件下旋链角毛藻生长特性
由图1A可知,在高磷培养条件下,旋链角毛藻经历了短暂的起始期,藻类在第3天进入了第一个指数生长期,且指数生长期一直持续到第12天,细胞密度达到2.0×109 cell/L,藻类在第12-15天进入第一个维持期。之后,旋链角毛藻又进入了新一轮的指数生长期,且指数生长持续到第21天,细胞密度达到3.0×109 cell/L,在第21-24天藻类又进入了维持期。随后旋链角毛藻在第24天又开始了指数生长直至实验结束,细胞密度最高达到5.0×109 cell/L。在本实验周期(30天)内,旋链角毛藻在经历3天的起始期后,先后出现3个指数生长期和2个维持期。由图1C可知,培养基中磷酸盐浓度在第0-12天快速减少,第12-30天缓慢减少。旋链角毛藻细胞小,细胞壁薄,生长周期短,经过3天的起始期之后进入指数生长期,指数生长期有10天左右,随后进入稳定期,这与茅华等[24]研究结果基本一致。旋链角毛藻在经过维持期后,再一次进入指数生长期,一方面可能是由于维持期部分藻类死亡释放磷营养(碱性磷酸酶水解有机磷等因素),另外,此时培养基中磷酸盐浓度为0.60 μM以上,仍可满足旋链角毛藻继续生长;另一方面可能与取样时对体系的扰动有关,取样前较大幅度摇匀藻液会加速磷营养的重新释放。类似的现象在甲藻中也存在,沈盎绿等研究发现[25],东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)和米氏凯伦藻在维持期结束后又进入了指数生长期,而本研究的旋链角毛藻生长更快、周期更短,出现了更多的指数生长期。
由图1B可知,在低磷培养条件下,旋链角毛藻在培养的第0-12天不断增长,细胞密度可达8.4×107 cell/L,处于一个明显的指数生长期,但是在培养至第12-24天时,细胞密度在一定范围内(8.3×107~9.2×107 cell/L)波动而且呈缓慢下降趋势,藻类生长过渡到维持期,在实验最后阶段,藻类密度又明显增加,可能再次进入一个指数生长期。由图1D所示,磷酸盐浓度一直处于较低水平,在第0-6天逐渐减少,在第6-24天逐渐增加,第24-30天又呈减少趋势。由此可知,在第0-6天,细胞吸收水中的磷酸盐并将其转化为PolyP,以此来满足自身的生长需求,但生长速度相对高磷培养组来说较为缓慢。之后水体中磷酸盐过低(<0.1 μM,图1D),这可能导致藻类细胞无法维持生长所需,因此,培养体系中旋链角毛藻密度反而有所下降,之后水体中磷酸盐有所回升但上升不显著(P>0.05),这可能是藻细胞死亡、分解并且重新释放营养盐的缘故,因为当培养体系中磷酸盐浓度过低时,藻类细胞中碱性磷酸酶将水体中的有机磷转化为无机磷[26],从而在实验快结束的时候,藻类再次利用水体中的营养盐开始新的快速生长。
2.2 旋链角毛藻不同生长阶段细胞质和细胞核PolyP变化特征
在高磷培养条件下,由图2A可知,细胞质PolyP含量呈波动上升趋势,在第18天最高(0.46 fmol/cell),然后波动下降。细胞质LC-PolyP变化趋势也类似,在第18天最高(0.36 fmol/cell),之后呈波动下降。而细胞质SC-PolyP变化则较平稳,一直在0.08~0.22 fmol/cell波动。旋链角毛藻细胞质PolyP、SC-PolyP和LC-PolyP含量在起始期、指数生长期和维持期之间差异不显著(P>0.05)。由图3A可知,在第0-12天,旋链角毛藻细胞LC-PolyP占比较少;第15-21天LC-PolyP占比多;第24-30天LC-PolyP占比少;在第18天LC-PolyP占比最多;在第24天LC-PolyP占比最少。由图2B可知,旋链角毛藻细胞核PolyP在第0-6天快速下降,之后相对稳定,第6-30天在0~0.2 fmol/cell波动,细胞核LC-PolyP与SC-PolyP变化趋势也类似。旋链角毛藻细胞核PolyP和SC-PolyP含量在起始期显著高于指数生长期,细胞核LC-PolyP含量在起始期显著高于指数生长期和维持期(P<0.05)。由图3B可知,旋链角毛藻细胞核内长短链占比一直呈波动变化,其中第0-6天、第12天、第21天和第27天,SC-PolyP占比均低于50%。总的来说,细胞质PolyP一直处于波动状态,其中,当旋链角毛藻生长处于维持期刚结束生长期刚开始时(第18天、第27天),细胞质LC-PolyP含量处于一个较高水平,同时占比与前后几天相比也较高(图2A和图3A),这主要是因为藻类在指数生长期细胞质储存的LC-PolyP转为SC-PolyP转运至细胞核用于生长,而在维持期藻类生长减缓,对SC-PolyP需求也减缓,从而导致LC-PolyP累积占比增加。旋链角毛藻细胞核PolyP则是先快速减少,之后小幅波动,这种现象可能是由于细胞生长时优先利用细胞核PolyP。相对于细胞质而言,细胞核PolyP对藻类生长响应更为灵敏,从PolyP长、短链占比来看,其变化趋势很好地符合藻类生长对细胞核SC-PolyP的需求过程。其中,第12天、第21天是藻类两个指数生长期的末期,藻密度达到峰值,同时SC-PolyP含量处于波谷状态而且占比也是最低(分别为37%和24%,低于前后两个时间点),细胞核SC-PolyP最大程度地用于藻类生长。正如Voronkov等[27]研究发现,在高磷培养条件下,集胞藻细胞(Synechocystis sp.)吸收磷酸盐并将其储存在细胞内,生长24 h后细胞PolyP明显下降。Powell等[28]也发现,在高磷培养条件下,混合微藻细胞长短链PolyP不断积累,LC-PolyP是细胞储存磷的主要形式,当废水中的磷酸盐被消耗完后,微藻就会利用储存的PolyP生长,细胞中SC-PolyP和LC-PolyP也相应减少。同样地,Ruiz等[29]研究也发现,在适宜环境下,克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)细胞SC-PolyP和LC-PolyP在生长的起始期不断增加,当细胞进入指数生长期后开始减少,尤其进入维持期后,在较低水平上保持相对的稳定。
在低磷培养条件下,由图2C可知,旋链角毛藻细胞质PolyP不断减少,细胞质LC-PolyP变化趋势也类同,而SC-PolyP则相对稳定,在0.1 fmol/cell附近波动,细胞质PolyP和SC-PolyP含量在指数生长期和维持期之间差异不显著(P>0.05),而LC-PolyP含量在指数生长期显著高于维持期(P<0.05)。由图3C可知,旋链角毛藻在第0天时细胞质LC-PolyP占比多,之后占比逐渐减少,第18-24天LC-PolyP在细胞质中占比约30%,在第30天LC-PolyP占比又增加。由图2D可知,旋链角毛藻细胞核PolyP及LC-PolyP都呈下降趋势,而SC-PolyP则先减少后增加,细胞核PolyP、SC-PolyP和LC-PolyP含量在指数生长期和维持期的均值之间均没有显著差异(P>0.05)。由图3D可知,旋链角毛藻细胞核SC-PolyP不断增多,在第18-30天细胞核SC-PolyP占比达一半以上。因此,当环境磷胁迫时,藻类细胞质内作为磷库储存的LC-PolyP会逐步酶解成SC-PolyP,然后转运至细胞核用于藻类生长,所以藻类细胞质LC-PolyP占比逐步减少,实验后期(尤其是第30天)LC-PolyP占比增加可能是此时藻类重新吸收了水体中死亡个体分解的磷酸盐的缘故(图2C和图3C)。而旋链角毛藻细胞核SC-PolyP在前12天快速下降,占比也低于50%(图2D和图3D),这极有可能是这期间藻类快速生长(图1B),细胞核SC-PolyP用于细胞生长所致,之后旋链角毛藻生长进入维持期细胞生长大幅减缓,对SC-PolyP需求也减缓,所以在细胞核中逐步累积而导致占比也偏高。类似的现象在其他研究中也有发现,Ruiz等[29]研究发现,当克氏锥虫处于环境胁迫时,5~10 min内细胞SC-PolyP和LC-PolyP迅速减少,20 min后LC-PolyP下降到最低水平,而SC-PolyP则相对稳定。Kulaev等[30]研究也发现,在低磷培养条件下,酿酒酵母细胞PolyP迅速减少,LC-PolyP被降解为SC-PolyP供细胞吸收,而且在低磷条件下,细胞生长主要依赖液泡(细胞质)内储存的PolyP。
另外,当旋链角毛藻细胞处于指数生长期时,高磷组细胞质SC-PolyP、细胞核PolyP显著高于低磷组(P<0.05);当细胞处于维持期时,高磷组细胞总PolyP、细胞质PolyP显著高于低磷组(P<0.05)。而金文育等[5]研究发现,高磷组(40 μM)和低磷组(5 μM)的米氏凯伦藻细胞内PolyP之间没有显著差异性,其原因为米氏凯伦藻在高磷和低磷培养条件下的藻细胞密度相差不是很大。而本实验发现,旋链角毛藻高磷组藻细胞密度显著高于低磷组(P<0.05),因高磷组中的藻类可以不断地从水体中吸收磷酸盐,最终在细胞内转化为PolyP;而低磷组中的藻类从水体中可吸收利用的磷酸盐有限,在细胞内累积的PolyP被快速用于生长,导致细胞内PolyP较低。
2.3 旋链角毛藻生长与细胞内PolyP的相关性
在高磷培养条件下,旋链角毛藻细胞总PolyP与细胞密度呈显著负相关性,相关系数为−0.575,但细胞质总PolyP与藻细胞密度没有显著相关性,细胞核总PolyP与藻细胞密度呈显著负相关性,相关系数为−0.585。细胞质SC-PolyP和LC-PolyP与细胞密度相关性不强,但细胞核SC-PolyP和LC-PolyP与细胞密度呈显著负相关性,相关系数分别为−0.465与−0.423(图4A)。出现这种现象的主要原因如下:在实验早期(前18天),细胞吸收培养基中的磷酸盐储存在细胞质内(以细胞磷库形式存在),故细胞质PolyP呈上升趋势;之后水体中磷酸盐浓度下降,细胞很难从水体中直接利用磷酸盐用于细胞增殖,此时细胞质LC-PolyP酶解成SC-PolyP转运至细胞核继续供细胞增殖。因此,细胞质与细胞生长相关性不紧密,而细胞核与细胞生长密切相关。这和Solovchenko等[31]的研究结果一致,高磷条件下培养小球藻(Chlorella vulgaris)时,其生长也与细胞总PolyP密切相关,随着小球藻细胞密度的增加,细胞总PolyP在不断减少。
在低磷培养条件下,旋链角毛藻细胞总PolyP与藻细胞密度呈显著负相关性,相关系数为−0.681。细胞质PolyP和LC-PolyP与藻细胞密度呈显著负相关性,相关系数分别为−0.599和−0.617(图4B)。这主要是因为旋链角毛藻细胞质LC-PolyP整体上占比较高,而且细胞生长对SC-PolyP需用较大,外界磷酸盐无法及时供应,细胞质储存的LC-PolyP快速分解为SC-PolyP并转运至细胞核,藻密度与PolyP和LC-PolyP变化趋势比较一致。细胞核PolyP和LC-PolyP也与藻细胞密度呈显著负相关性,相关性系数分别为−0.678和−0.608(图4B)。藻类细胞核PolyP直接用于细胞生长,其响应速度比细胞质更加灵敏,所以与细胞质的变化规律基本一致。但是细胞核SC-PolyP与细胞密度之间相关性不显著,这可能是在低磷条件下,在实验前期(12天内)细胞生长时会很快消耗细胞核SC-PolyP,但后期生长缓慢,总的来说藻密度呈先快速升高然后进入维持期,藻密度变化趋势比较单一,而SC-PolyP含量在前期下降较快而后期则缓慢升高,整体变化趋势出现较大的波动。Falkner等[32]发现,在低磷培养条件下,利奥波德聚球藻(Synechococcus leopoliensis)利用储存在细胞内的PolyP进行生长分裂,即细胞生长与细胞内PolyP含量呈显著负相关性。Ruiz等[29]也发现,在环境胁迫下培养的克氏锥虫生长与细胞内SC-PolyP和LC-PolyP呈显著负相关性。
3 结 论
在高磷培养条件下,旋链角毛藻细胞内总PolyP、细胞核内PolyP(包括SC-PolyP和LC-PolyP)与藻细胞密度呈显著负相关性。旋链角毛藻细胞核内PolyP和SC-PolyP含量在起始期显著高于指数生长期,细胞核LC-PolyP含量在起始期显著高于指数生长期和维持期(P<0.05)。在低磷培养条件下,旋链角毛藻细胞内总PolyP、细胞质和细胞核内PolyP和LC-PolyP与藻细胞密度呈显著负相关性,细胞质内LC-PolyP含量在指数生长期显著高于维持期。今后研究还可以同步测定细胞总颗粒磷,确定细胞内PolyP在细胞总磷中的占比,从而进一步明确PolyP在藻类细胞生长周期中的作用。综上所述,开展旋链角毛藻细胞PolyP的储存利用机制可为深入了解硅藻赤潮的暴发机制提供一种新思路。
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