Study on the ability of phosphate-solubilizing bacteria Bacillus sp. to solubilize phosphate in different types of sediments of Swan Lagoon
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摘要:
磷是海洋浮游植物生长所必需的营养元素，而过量的磷负荷会导致水体富营养化。解磷菌是影响磷再生的一个重要因素，在水体磷的生物地球化学循环中发挥着关键作用。为了研究无机解磷菌（IPB）对天鹅湖瀉湖不同湖区沉积物的解磷能力，本研究以前期从湖中心沉积物中筛选的两株芽孢杆菌属（Bacillus sp.）解磷菌及4个湖区的表层沉积物为试验材料，通过室内模拟试验分析了不同解磷菌接种条件下水体pH、DO、总磷（TP）、可溶性磷（SRP）等参数的动态变化，探究了解磷菌对沉积物各形态无机磷转化的影响。结果表明，试验期间，上覆水体DO浓度及pH均呈不同程度的下降趋势，沉积物−水界面很快达到厌氧状态。解磷菌接种促进了天鹅湖沉积物中磷的释放，菌株及湖区的不同均对上覆水体TP浓度有显著影响。试验期间，接种处理的上覆水体SRP浓度变幅为0.009～0.666 mg/L；两种菌株对不同湖区沉积物的解磷能力存在明显差异，其中弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus）对西北部湖区沉积物的解磷能力最强，水体中SRP浓度增幅为0.510 mg/L；而巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）对南部湖区砂质沉积物的解磷能力最强，增幅为0.583 mg/L。试验结束时，弯曲芽孢杆菌接种组沉积物中NaOH-P含量均有所下降，降幅为2.49～30.36 mg/kg，其中西北部湖区降幅最大；南部湖区的BD-P含量在不同接种条件下均有所下降，且巨大芽孢杆菌组降幅大于弯曲芽孢杆菌组；其余磷形态的含量变化不明显。研究表明，天鹅湖不同湖区沉积物中无机磷含量差异较大，颗粒较细的湖中心和西北部含量较高。在IPB接种条件下，瀉湖不同湖区沉积物磷的释放能力存在差异，其中西北部湖区沉积物受微生物活性影响最大，解磷菌对该湖区沉积物内源磷释放的贡献不容忽视。
Abstract:Phosphorus (P) is an essential nutrient element for the growth of phytoplankton. However, excessive P loading can cause water eutrophication. Phosphate-solubilizing bacteria is an important factor affecting P regeneration and play a key role in P biogeochemical cycle in waters. To explore the effect of inorganic phosphate-solubilizing bacteria (IPB) on P release from the sediments at different areas of Swan Lagoon, we conducted a simulation experiment using two dominant IPB strains (Bacillus sp.) isolated from the central lake and surface sediments from four lake areas. The dynamic changes in pH, DO, total phosphorus (TP), and soluble reactive phosphorus (SRP) concentrations in the overlying water under different inoculations of IPB strains were analyzed. In addition, the effect of IPB on the transform of P fractions in sediments was determined. The results showed that the DO concentrations and pH in the overlying water decreased at different degrees, and the sediment-water interface quickly reached an anaerobic condition during the experiment. The IPB inoculation promoted the release of P from the sediments of Swan Lagoon, and IPB strain and lake area both had significant effect on TP concentration of the overlying water. SRP concentrations in overlying water under different incubation treatments ranged from 0.009 to 0.666 mg/L. There was considerable difference in the ability of two strains to solubilize phosphate in the sediments from different lake areas. The Bacillus flexus had the strongest phosphate-solubilizing ability under the treatment of the northwest lake, and the SRP concentration in the overlying water increased by 0.510 mg/L. Bacillus megaterium had the strongest phosphate-solubilizing ability under the treatment of sandy sediment in the south lake, with a SRP increase of 0.583 mg/L. At the end of the experiment, the NaOH-P content in sediments decreased in B. flexus inoculation group, ranged from 2.49 to 30.36 mg/kg, with the greatest decrease in the northwestern lake. BD-P content in the southern lake decreased under different inoculation conditions, and the decrease was greater in the B. megaterium group than that in the B. flexus group. Whereas, the content of other P forms in sediments did not change significantly. The inorganic P contents in sediments varied greatly at different areas of Swan Lagoon, with high values occurring in the central and northwestern lake. The results indicate that the P release capacity of the sediments differed across different lake areas after the IPB inoculation, and the highest effect of microbial activity on P release was observed in the sediments from the northwestern lake. In Swan Lagoon, the contribution of IPB to sediment P release at this area should not be ignored.
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磷是大多数水体初级生产力的限制性营养元素，过量磷负荷是导致富营养化和有害藻华暴发的原因之一[1]。外源磷的持续输入使得大量磷在沉积物中积累，此时沉积物起到“汇”的作用；而当外源污染减缓时，沉积物磷的内源释放可在较长时间内成为水体磷的重要来源[2-3]。微生物活动可明显促进沉积物磷向上覆水体释放，从而改变水体的营养水平。解磷菌（PSB）可通过自身代谢、改变环境条件等方式将沉积物中难溶性磷化合物转化为可溶性磷（SRP），进而释放进入上覆水体，在沉积物内源磷的释放过程中发挥着重要作用。Qu等[4]将PSB接种至官厅水库沉积物，发现PSB可加速沉积物磷向上覆水体的释放，而改变介质pH可影响其释放速率。Li等[5]研究也发现，根瘤菌属PSB的接种使得蓝藻对磷的吸收增强。PSB可分为有机解磷菌（OPB）和无机解磷菌（IPB）两类，有研究表明接种IPB可比OPB产生更多的SRP[6-7]，在三峡水库等沉积物中IPB数量多于OPB[8]。一般认为，酸解为IPB的主要解磷机制，即通过氧化或氧化呼吸途径分泌小分子有机酸来溶解无机磷酸盐。在不同生境水体的沉积物中PSB的优势种属与解磷特性存在明显差异[9-10]，其中芽孢杆菌（Bacillus）是IPB的优势属之一[11-12]。
微生物在沉积物磷的形态转化过程中起着重要作用。Wang等[11]研究表明，PSB不仅能促进磷的溶解，还能将磷以无机或有机磷的形式保存在细胞体内，然而在厌氧环境下细胞中的磷可大量释放，使得水体磷浓度明显升高。在不同水域，沉积物磷的内源负荷及赋存形态存在很大差异。例如，在雅鲁藏布江和天鹅湖瀉湖，钙结合态磷（HCl-P）是无机磷的主要赋存形态[13-14]，而太湖沉积物中铁铝结合态磷（NaOH-P）含量较高[15]。沉积物中各形态磷由于生物有效性的不同，其对上覆水体富营养化的贡献也存在差异。一般认为，弱结合态磷（NH4Cl-P）、可还原态磷（BD-P）和NaOH-P活性较强，而HCl-P相对稳定[16-18]。然而在有些水域，沉积物中HCl-P也具有较大的释放潜力[19-20]。例如，Kisand等研究发现普罗萨湖沉积物中HCl-P的释放率可高达50%，而在凯弗莱湖其含量基本保持不变[21]。PSB作为磷素活化和形态转化的主要执行者，在沉积物磷释放过程中起着关键作用。例如，Li等[22]将从三岔湖分离得到的小单胞菌（Micromonospora）、假单胞菌（Pseudomonas）等属IPB接种至沉积物中，发现4株IPB均显著促进了HCl-P的溶解释放，而BD-P和NaOH-P含量变化不大；Maitra等[9]研究表明，HCl-P不是PSB可以溶解的唯一磷形态；Chang等[23]研究发现NaOH-P在滇池沉积物中具有最高的释放风险。由上可见，沉积物中不同形态无机磷因环境差异、微生物作用等而具有不同的释放潜力。目前，PSB对沉积物磷形态转化的影响机制尚不清晰，针对芽孢杆菌属IPB对瀉湖沉积物解磷能力的报道较少。
荣成天鹅湖是位于山东半岛的一个天然瀉湖，其东南端与荣成湾相连，水体交换受潮汐影响较大，大部分区域水深在2 m以内。在天鹅湖，曾分布有大量鳗草（Zostera marina）及贝类等生物资源；然而近10年来，丝状硬毛藻（Chaetomorpha spp.）在湖内频繁暴发，对海草床生境和底栖生物群落产生很大影响[24-25]，并给海水养殖业造成了严重的经济损失。藻华生消过程使得沉积物−水界面环境发生明显改变，从而导致沉积物中细菌群落结构发生变化[26]。本研究选取从天鹅湖分离的两株无机芽孢杆菌属PSB株作为试验材料，比较其对天鹅湖不同湖区沉积物的解磷能力，分析不同形态磷在接种前后的含量变化，旨在探究芽孢杆菌属IPB接种对不同底质沉积物磷释放的影响规律，以期为近海沉积物内源污染的控制提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
2022年9月，在天鹅湖4个湖区采集表层沉积物（0～5 cm）和底层湖水，样点位置如图1所示。S1样点靠近虾池，沉积物为黏质，黑臭，多藻碎屑；S2样点靠近生活区，沉积物为黏砂质，有较多螺和贝壳；S3样点水位较深，有大量硬毛藻和鳗草生长，沉积物黏质，植物根系较多；S4样点沉积物为砂质，大叶藻根系较多，含有少量贝壳。
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图 1 荣成天鹅湖的地理位置及样点分布Fig. 1 Geographic location of Rongcheng Swan Lagoon and the distribution of sampling sites沉积物样品现场混匀后，冷藏运回实验室，测定磷形态、粒度及元素组成等，其余样品冷藏避光保存备用（4 ℃）。各样点上覆水、间隙水的总磷（TP）、SRP浓度以及沉积物的基本理化参数见表1。采集大量湖中心（S3样点）湖水，实验室内进行煮沸灭菌，以供后续模拟试验使用。
表 1 天鹅湖各样点上覆水、间隙水及沉积物的基本理化特性Tab. 1 Physico-chemical parameters of the overlying water, pore water and sediments at different sites in Swan Lagoon样点 上覆水 间隙水 沉积物 pH TP/mg·L−1 SRP/mg·L−1 TP/mg·L−1 SRP/mg·L−1 TP/mg·kg−1 黏粒< 2 μm/（%） 沙粒> 50 μm/（%） S1 7.75 ± 0.21 0.075 ±0.003 0.014 0.89 ± 0.08 0.17 ± 0.02 358.10 ± 5.24 14.63 ± 2.02 55.12 ± 2.57 S2 7.84 ± 0.09 0.110 ± 0.005 0.045 0.49 ± 0.03 0.33 ± 0.05 435.16 ± 7.49 12.09 ± 1.50 57.36 ± 2.19 S3 7.63 ± 0.17 0.034 ± 0.003 0.014 0.54 ± 0.03 0.27 ± 0.03 397.55 ± 8.80 29.85 ± 2.33 27.67 ± 1.03 S4 7.79 ± 0.26 0.050 ± 0.007 0.015 0.41 ± 0.06 0.30 ± 0.07 320.27 ± 1.37 4.67 ± 0.57 87.78 ± 3.17 注：表中数据为3次测定结果的平均值；SRP浓度的标准差由于小于其均值的15%，因此未标注标准差 供试菌株：选用实验室近期从天鹅湖湖中心沉积物中分离的两株优势IPB，其中菌1、菌2分别为弯曲芽胞杆菌（Bacillus flexus）和巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）。将冷冻保存的IPB接种到液体牛肉膏蛋白胨培养基中，37 ℃富集培养24 h，之后将培养液以8000 rpm离心10 min，用灭菌湖水重悬菌体，调整菌悬液OD600在1.0左右（菌量为1.0 × 108 CFU/g），备用。
1.2 试验设计
选取4个样点的新鲜沉积物进行接种试验。分别称取300 g沉积物平铺于2.0 L的高型烧杯底部，灭菌处理后加入20 mL菌悬液和3 g葡萄糖混匀，之后缓慢注入1.8 L灭菌湖水。烧杯外用黑色薄膜进行遮光处理。沉积物及试验所用器材均于高压灭菌器中121 ℃灭菌30 min。每个样点设置3个处理：水+沉积物+菌1、水+沉积物+菌2、水+沉积物（对照），共12个处理，3次重复，周期为14 d。试验期间，每天于测定前3 h轻轻搅动水体5 min，使上覆水混合均匀。
试验过程中，每2 d监测一次上覆水的pH和DO浓度变化，并于沉积物−水界面上方3 cm处抽取水样，分析上覆水体的TP和SRP浓度；试验结束时测定新鲜沉积物中磷的赋存形态。
1.3 样品测定方法
界面pH、DO浓度采用多参数分析仪（YSI 6600）测定；水体TP采用过硫酸钾消解，钼锑抗分光光度法比色测定[27]；水样过滤后采用钼锑抗分光光度法测定水体SRP。沉积物无机磷形态的测定采用化学连续提取法[28]，该方法将无机磷分为NH4Cl-P、BD-P、NaOH-P和HCl-P，依次用1.0 mol/L NH4Cl、0.11 mol/L NaHCO3/Na2S2O4、0.1 mol/L NaOH和0.5 mol/L HCl提取。
1.4 统计分析
采用IBM SPSS Statistics 27.0统计软件对试验数据进行方差分析、相关性分析及T检验。采用两因素方差分析检验不同样点、不同菌株对水体磷水平及沉积物各形态磷含量的影响，之后对不同接种组的各处理间进行Duncan法差异显著性检验（p<0.05）。利用Origin 2021软件进行绘图。
2 结果与讨论
2.1 IPB培养过程中沉积物−水界面理化因子的变化
2.1.1 底层水体DO浓度的变化
在不同IPB接种条件下，上覆水体中DO浓度整体呈下降趋势（图2），且很快达到厌氧状态，可能原因为菌株生长呼吸消耗了大量氧气。试验前期（3～5 d），弯曲芽孢杆菌接种组DO浓度迅速降低（图2a），7 d后基本稳定（低于1.30 mg/L），样点间差异较小。不同样点相比，S4样点在第3 d时DO浓度最高，之后随时间急剧下降，降幅达6.12 mg/L。巨大芽孢杆菌接种条件下，4个样点的DO浓度差异较大，变幅为0.27～3.63 mg/L（图2b），其中S3样点DO浓度随时间波动最大，降幅为3.03 mg/L，在前5 d显著高于其他样点（p<0.05），而当试验结束时各样点DO浓度表现为S1>S4>S3>S2。与弯曲芽孢杆菌接种组相比，巨大芽孢杆菌接种组的厌氧状态更加明显（如S4样点始终处于厌氧状态），说明巨大芽孢杆菌在各样点的生长状态优于弯曲芽孢杆菌。各样点对照处理的DO浓度变幅为0.33～5.93 mg/L（图2c），前期表现为S1>S3>S2>S4，后期样点间差异不大。试验期间对照处理DO浓度的下降可能是由于少量细菌随空气进入沉积物导致葡萄糖降解耗氧。
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图 2 不同处理下沉积物−水界面DO浓度的变化Fig. 2 Changes in dissolved oxygen concentration at the sediment-water interface under different treatments总的来说，IPB的接种对不同样点底层水的DO浓度产生了一定影响，其中对S4样点的影响最大，S3样点次之。对两种IPB进行比较可以看出，各样点接种弯曲芽孢杆菌后DO浓度的降幅均明显大于接种巨大芽孢杆菌，可见弯曲芽孢杆菌的接种对各样点水体DO浓度的影响更大。
2.1.2 底层水体pH的变化
酸解是PSB对难溶性无机磷酸盐的主要解磷机制，其通过产生有机酸等来降低介质的pH，从而促进无机磷的溶解[10, 29]。在本接种试验中，所有处理上覆水体的pH均明显下降（图3），主要原因可能是菌株的呼吸作用及有机酸分泌[30]。弯曲芽孢杆菌接种组各处理水体pH变幅为4.61～7.75（图3a），试验期间pH随时间呈降低趋势，但在试验后期S2、S3样点略有回升，而S1、S4样点则继续下降，其中S4样点降幅最大（2.86），结束时表现为S3（a）>S2（b）>S1（c）>S4（d）（注：不同小写字母代表各处理在0.05水平上具有显著性差异，下同）。在巨大芽孢杆菌接种条件下（图3b），S2、S4样点pH出现明显变化，在前期急剧下降，第7 d达到最低，此时均显著小于S1、S3样点（p<0.05），但之后又有所上升，这可能与菌株的大量繁殖导致部分菌体死亡或发生自溶释放出碱性物质等有关[31-32]；而S1、S3样点则未发生明显变化；在整个试验过程中，S2样点降幅最大（2.21）。不同湖区的对照处理水体pH变幅为4.60～7.79（图3c）；试验前期S2样点降幅最大，第7 d达到最低，其余3个样点间差异不大；试验结束时，S1、S4样点的pH显著低于S2、S3样点（p<0.05），样点间的pH差异可能是不同湖区沉积物对pH的缓冲能力不同所致。
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图 3 不同处理下沉积物−水界面pH的变化Fig. 3 Changes in pH at the sediment-water interface under different treatments对比两种IPB可以发现，试验前7 d，4个样点水体pH均表现为接种巨大芽孢杆菌组小于接种弯曲芽孢杆菌组；而试验结束时与初始值相比，4个样点接种弯曲芽孢杆菌组的pH降幅均大于接种巨大芽孢杆菌组。
2.2 IPB接种对不同湖区上覆水体磷浓度的影响
2.2.1 水体总磷浓度的动态变化
由图4a可见，弯曲芽孢杆菌接种组各处理的水体TP浓度均随时间呈迅速上升趋势，其中S2、S4样点增幅较大，分别为0.735 mg/L和0.581 mg/L，而S1、S3样点变化较小。S4样点的TP浓度在试验前期变化不大，8 d后开始迅速增加；S2样点在整个试验期间TP浓度一直高于其他样点，第10 d时差异达到显著水平（p<0.05）；在试验结束时4个样点表现为S2（a）>S4（b）>S1（c）>S3（c）。而在巨大芽孢杆菌接种组（图4b），第2～10 d，S4样点TP浓度高于S2样点，两样点均在第10 d达到最大值，且显著高于其余两个样点（p<0.05）；试验期间S4样点增幅最大（0.662 mg/L），S2样点次之。对照组的变化趋势与弯曲芽孢杆菌接种组类似（图4c），前8 d各样点间TP浓度差异较小（S2除外），之后4个样点的差异逐渐增大。第10～14 d，对照组TP浓度仍处于上升状态，而巨大芽孢杆菌接种组的部分处理则呈现下降趋势，这可能是PSB为了维持自身生存而消耗了部分磷所致[26]。
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图 4 不同处理下水体TP的浓度变化Fig. 4 Changes in total phosphorus concentration in water under different treatments比较不同菌株的接种效果可以看出，S2样点和S3样点均表现为接种弯曲芽孢杆菌组的水体TP浓度始终高于巨大芽孢杆菌；除S4样点外，其余样点巨大芽孢杆菌接种组的增幅均小于弯曲芽孢杆菌接种组；S1样点不同菌株处理间差异较小。在试验结束时，两个接种组TP浓度增幅均大于对照组，说明芽孢杆菌属PSB的接种促进了沉积物磷向上覆水体的释放。
2.2.2 水体可溶性磷浓度的动态变化
PSB可将沉积物中难溶性磷转化为可溶性磷，从而释放进入上覆水体[7, 9]。上覆水体SRP浓度的变化趋势与TP类似，均随时间呈上升趋势（图5）。弯曲芽孢杆菌接种组的SRP浓度变幅为0.009～0.572 mg/L，其中S2样点增幅最大（0.558 mg/L），S4样点次之，而S1样点、S3样点变幅较小（图5a）。试验期间S2样点浓度始终高于其余样点，第10 d时表现为S2（a）>S4（b）>S3（b）>S1（b）。对于巨大芽孢杆菌接种组（图5b），S4样点SRP浓度始终高于其他样点，且增幅最大（0.617 mg/L）。S2样点在第12 d急剧下降，而S1样点和S3样点一直处于较低水平（0.014～0.208 mg/L），在试验结束时各样点表现为S4（a）>S2（b）>S1（b）>S3（c），说明巨大芽孢杆菌对湖南部沉积物具有较强的解磷能力，这与王效昌等的研究结果类似[33]。在对照组，整个试验期间S2样点始终处于最高水平（图5c），其余样点在前8 d差异较小，之后S4样点迅速上升，第14 d时表现为S2（a）>S4（a）>S3（b）>S1（b）。
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图 5 不同处理下水体SRP的浓度变化Fig. 5 Changes in soluble reactive phosphorus concentration in water under different treatments两因素方差分析结果（表2）表明，沉积物、菌株对水体磷浓度的影响均达到显著水平（p<0.05）。S4样点在前12 d始终表现为巨大芽孢杆菌接种组水体SRP浓度较高，其余3个样点则均表现为弯曲芽孢杆菌接种组的水体TP、SRP浓度增幅大于巨大芽孢杆菌接种组，其中S3样点两菌株间差异较大，S2样点增幅最大（0.558 mg/L），说明弯曲芽孢杆菌对天鹅湖大部分湖区沉积物的解磷能力强于巨大芽孢杆菌。对水体TP、SRP、pH、DO等指标进行相关性分析发现，TP、SRP浓度均与pH呈极显著负相关关系（r=−0.96，p<0.01）；S2样点和S4样点水体pH降幅较大，且沉积物磷释放量较大，说明芽孢杆菌属IPB可通过降低pH来促进天鹅湖瀉湖沉积物内源磷的释放[10, 34]。
表 2 两因素方差分析检验样点和菌株对上覆水体磷浓度的影响Tab. 2 Two-way ANOVA for effects of sampling site and IPB strain on phosphorus concentration in overlying water误差来源 因变量 自由度df 均方 F p 样点 TP 3 0.243 35.369 <0.001 SRP 3 0.120 16.615 <0.001 菌株 TP 2 0.028 4.071 0.030 SRP 2 0.022 3.067 <0.001 样点×菌株 TP 6 0.059 8.598 <0.001 SRP 6 0.064 8.854 <0.001 2.2.3 磷释放能力与沉积物理化性质的关系
由于沉积物的营养负荷、磷赋存形态、理化性质等差异，同一湖泊的不同湖区沉积物磷的释放能力也存在较大差异[35-36]。本模拟试验结果表明，未接种条件下（对照组）上覆水体TP、SRP浓度均表现为S2（西北部）>S4（南部）>S1（北部）、S3（湖中心），其中S2样点远高于其他样点，说明西北部湖区沉积物具有较强的释磷能力。这与天鹅湖不同湖区沉积物的营养负荷、粒度、矿物组成等理化性质有关。S2样点靠近生活区，受生活污水排放等因素影响，水体TP和SRP浓度均最高（表1），沉积物中磷负荷及活性磷含量也较高[37]；S3样点位于湖中心的深水区，附近有大量藻类生长，沉积物中富含营养盐和有机质[38]。在西北部湖区及湖中心，沉积物粒径较细，均为粘质，黏土矿物含量较高（表1），以水云母为主，高岭石次之，主要组成元素为硅和铝（图6）；南部湖区（S4样点）附近有鱼虾养殖池和农田，饵料投喂和农业面源污染是水体营养盐的主要来源，沉积物粒径较粗，砂质，矿物类型以石英及长石为主，钠元素含量最高，对水体磷的吸附能力相对较弱[39]。
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图 6 不同湖区沉积物的扫描电镜-X射线能谱分析Fig. 6 Images of scanning electron microscopy and X-ray spectroscopy of sediments from different lake areas2.3 解磷菌接种对不同湖区沉积物磷形态的影响
NH4Cl-P是沉积物中较易释放的一种磷形态[17, 40]。对于S4样点，巨大芽孢杆菌接种条件下沉积物中NH4Cl-P含量明显降低（图7a），弯曲芽孢杆菌接种组NH4Cl-P含量显著高于巨大芽孢杆菌接种组（p<0.05）；而其他处理的NH4Cl-P含量均比初始值有所上升，其中S2样点的对照处理增幅最大（1.54 mg/kg），说明可能存在其他形态磷向NH4Cl-P的转化。Zhao等[41]对乌梁素海的研究也发现，酸性条件下（pH=4）沉积物中NH4Cl-P含量显著增加，增幅为63.1%。对试验结束时各形态磷含量进行方差分析（表3），发现样点、样点×菌株均对NH4Cl-P含量具有极显著影响（p<0.01），菌株对其具有显著影响（p<0.05）。
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图 7 不同处理下沉积物各形态磷的含量Fig. 7 Contents of different phosphorus forms in sediments under different treatments表 3 两因素方差分析检验样点和菌株对沉积物磷形态的影响Tab. 3 Two-way ANOVA for effects of sampling site and IPB strain on phosphorus fractions in sediments误差来源 因变量 自由度df 均方 F p 样点 NH4Cl-P 3 0.10 17.88 <0.001 BD-P 3 37.13 4.13 0.017 NaOH-P 3 991.73 117.22 <0.001 HCl-P 3 83284.50 62.39 <0.001 菌株 NH4Cl-P 2 0.22 4.02 0.031 BD-P 2 2.73 0.30 0.741 NaOH-P 2 1390.99 164.42 <0.001 HCl-P 2 1668.53 1.25 0.304 样点×菌株 NH4Cl-P 6 0.22 4.00 0.006 BD-P 6 10.37 1.15 0.363 NaOH-P 6 320.53 37.89 <0.001 HCl-P 6 1334.81 0.82 0.563 BD-P为氧化还原敏感性的磷形态，其迁移转化受DO浓度的影响较大。本研究中，样点不同对BD-P含量具有显著影响（p<0.05），而菌株对其影响不大（表3）。与初始值相比，在不同接种条件下S1样点和S2样点的BD-P含量均有所上升（图7b），表现为巨大芽孢杆菌接种组增幅较大；而S4样点在不同接种条件下BD-P含量均明显降低，其中巨大芽孢杆菌接种组的降幅较大（5.26 mg/kg），其沉积物−水界面的DO浓度也处于较低水平（图2），证实了BD-P在厌氧环境下的释放[42]。Ding等[43]对Pseudomonas sp.的研究发现，低DO条件可抑制ppk（多磷酸激酶）基因的表达，从而促进沉积物磷的释放；此外，厌氧条件下微生物也可通过将Fe3+还原成可溶性Fe2+等作用促进磷的释放[44]。
NaOH-P的活性受pH和DO浓度等影响较大，在碱性条件下较易释放[30, 45]。NaOH-P为接种试验前后含量变化最大的磷形态，样点及菌株均对其具有极显著影响（p<0.01）。由图7c可见，不同样点各接种处理的NaOH-P含量均高于其对照处理，巨大芽孢杆菌接种组显著高于弯曲芽孢杆菌接种组（p<0.05）（S4除外），S2样点的两菌株间差异最大（37.69 mg/kg）。与初始值相比，除S2样点、S3样点的巨大芽孢杆菌接种组外，其余处理均有所下降，说明天鹅湖沉积物中NaOH-P活性较强，这可能与低氧环境中铁结合态磷的还原释放等有关[44, 46]。Xu等[45]研究表明，NaOH-P含量与沉积物中磷的释放量呈正相关关系，其可对沉积物磷的释放潜力起有效的指示作用。在天鹅湖，外源污染严重的西北部湖区的NaOH-P含量显著高于其他3个样点（p<0.05），其对照处理的降幅最大（36.43 mg/kg），且S2样点上覆水体SRP野外调查结果也最高（表1），进一步说明沉积物中NaOH-P含量越高，沉积物磷释放的风险越大。不同菌株相比，弯曲芽孢杆菌接种组的降幅明显大于巨大芽孢杆菌接种组（S4样点除外），说明弯曲芽孢杆菌对沉积物中NaOH-P的释放具有较强的促进作用；部分处理NaOH-P含量有所增加，这可能与有机磷的矿化作用有关[29, 44]。在本研究区域，各样点界面pH均呈弱碱性，碱性释放可能不是NaOH-P的主要释放机制，且对照组大部分处理的其余形态磷含量有所增加，推测试验期间可能存在NaOH-P向其他形态磷的转化。
HCl-P在4种无机磷形态中含量最高（图7），是天鹅湖沉积物磷的主要赋存形态。一般认为HCl-P不易被生物利用，但其可在PSB作用下表现出一定的释放潜力[14, 47]。本研究中，S1样点在弯曲芽孢杆菌接种条件下HCl-P含量降幅为14.23 mg/kg（图7d），S4样点在巨大芽孢杆菌接种组降幅为2.96 mg/kg，且该样点对应处理的上覆水pH的降幅也较大（图2），说明酸性环境有利于沉积物中HCl-P的溶解[48]。试验后期（7～13 d），S2样点和S3样点的上覆水pH呈上升趋势，这可能促进了磷酸钙的沉淀，导致其沉积物中HCl-P含量升高[49]；此外，试验期间也可能存在其他形态磷向HCl-P的转化[50]。由上述分析可知，不同PSB接种条件下，沉积物各形态磷的活性及其释放潜力存在较大差异，且受到环境因子的影响，IPB对沉积物磷的促溶过程以及不同磷形态间的转化机制有待进一步研究。
综上所述，天鹅湖不同湖区沉积物的磷含量及赋存形态存在很大差异，NaOH-P在外源污染严重的西北部湖区含量最高，HCl-P在湖中心含量最高。芽孢杆菌属IPB的接种明显降低了水体的pH和DO浓度，从而促进沉积物磷的释放。但不同湖区沉积物磷的释放能力不同，且两菌株的解磷能力也存在差异，其中巨大芽孢杆菌对湖南部沉积物的解磷能力大于弯曲芽孢杆菌，而其余湖区表现为弯曲芽孢杆菌的解磷能力较强。不同PSB菌株对天鹅湖沉积物不同形态磷的促溶能力也明显不同，其中弯曲芽孢杆菌对NaOH-P含量的影响较大。在荣成天鹅湖，西北部沉积物中NaOH-P含量较高，且具有较强的释放潜力，NaOH-P的释放有可能成为维持该区域硬毛藻暴发的重要磷源，在今后内源污染治理过程中需引起高度重视。
3 结 论
（1）在接种IPB后，上覆水体pH和DO浓度明显降低。两株芽孢杆菌属PSB的接种均促进了天鹅湖沉积物中磷的释放，使得上覆水TP和SRP浓度明显增加；而不同湖区沉积物磷的释放能力存在差异，不同接种条件下均表现为西北部磷浓度增幅最大，湖南部次之。两株PSB的解磷效果也有所差异，其中巨大芽孢杆菌对湖南部沉积物的解磷能力较强，而其余湖区均表现为弯曲芽孢杆菌的解磷能力大于巨大芽孢杆菌。
（2）在不同PSB接种条件下，天鹅湖沉积物中各形态磷的释放潜力存在较大差异。两株芽孢杆菌属PSB的接种均使NH4Cl-P含量有所增加，其中西北部湖区增幅最大；弯曲芽孢杆菌的接种明显促进了NaOH-P的释放，其含量降幅为西北部>湖中心>湖北部>湖南部；试验期间湖南部处理的沉积物−水界面始终处于厌氧状态，从而促进了BD-P的释放，其中巨大芽孢杆菌接种组的含量降幅较大。
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图 1 荣成天鹅湖的地理位置及样点分布
Fig. 1. Geographic location of Rongcheng Swan Lagoon and the distribution of sampling sites
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图 2 不同处理下沉积物−水界面DO浓度的变化
Fig. 2. Changes in dissolved oxygen concentration at the sediment-water interface under different treatments
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图 3 不同处理下沉积物−水界面pH的变化
Fig. 3. Changes in pH at the sediment-water interface under different treatments
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图 4 不同处理下水体TP的浓度变化
Fig. 4. Changes in total phosphorus concentration in water under different treatments
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图 5 不同处理下水体SRP的浓度变化
Fig. 5. Changes in soluble reactive phosphorus concentration in water under different treatments
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图 6 不同湖区沉积物的扫描电镜-X射线能谱分析
Fig. 6. Images of scanning electron microscopy and X-ray spectroscopy of sediments from different lake areas
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图 7 不同处理下沉积物各形态磷的含量
Fig. 7. Contents of different phosphorus forms in sediments under different treatments
表 1 天鹅湖各样点上覆水、间隙水及沉积物的基本理化特性
Tab. 1 Physico-chemical parameters of the overlying water, pore water and sediments at different sites in Swan Lagoon
样点 上覆水 间隙水 沉积物 pH TP/mg·L−1 SRP/mg·L−1 TP/mg·L−1 SRP/mg·L−1 TP/mg·kg−1 黏粒< 2 μm/（%） 沙粒> 50 μm/（%） S1 7.75 ± 0.21 0.075 ±0.003 0.014 0.89 ± 0.08 0.17 ± 0.02 358.10 ± 5.24 14.63 ± 2.02 55.12 ± 2.57 S2 7.84 ± 0.09 0.110 ± 0.005 0.045 0.49 ± 0.03 0.33 ± 0.05 435.16 ± 7.49 12.09 ± 1.50 57.36 ± 2.19 S3 7.63 ± 0.17 0.034 ± 0.003 0.014 0.54 ± 0.03 0.27 ± 0.03 397.55 ± 8.80 29.85 ± 2.33 27.67 ± 1.03 S4 7.79 ± 0.26 0.050 ± 0.007 0.015 0.41 ± 0.06 0.30 ± 0.07 320.27 ± 1.37 4.67 ± 0.57 87.78 ± 3.17 注：表中数据为3次测定结果的平均值；SRP浓度的标准差由于小于其均值的15%，因此未标注标准差 
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表 2 两因素方差分析检验样点和菌株对上覆水体磷浓度的影响
Tab. 2 Two-way ANOVA for effects of sampling site and IPB strain on phosphorus concentration in overlying water
误差来源 因变量 自由度df 均方 F p 样点 TP 3 0.243 35.369 <0.001 SRP 3 0.120 16.615 <0.001 菌株 TP 2 0.028 4.071 0.030 SRP 2 0.022 3.067 <0.001 样点×菌株 TP 6 0.059 8.598 <0.001 SRP 6 0.064 8.854 <0.001
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表 3 两因素方差分析检验样点和菌株对沉积物磷形态的影响
Tab. 3 Two-way ANOVA for effects of sampling site and IPB strain on phosphorus fractions in sediments
误差来源 因变量 自由度df 均方 F p 样点 NH4Cl-P 3 0.10 17.88 <0.001 BD-P 3 37.13 4.13 0.017 NaOH-P 3 991.73 117.22 <0.001 HCl-P 3 83284.50 62.39 <0.001 菌株 NH4Cl-P 2 0.22 4.02 0.031 BD-P 2 2.73 0.30 0.741 NaOH-P 2 1390.99 164.42 <0.001 HCl-P 2 1668.53 1.25 0.304 样点×菌株 NH4Cl-P 6 0.22 4.00 0.006 BD-P 6 10.37 1.15 0.363 NaOH-P 6 320.53 37.89 <0.001 HCl-P 6 1334.81 0.82 0.563
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