Transcriptomic analysis of gene expression of Perinereis Aibuhitensis during single Cu, Cd stress
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摘要:
为探讨双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）响应重金属胁迫的作用机制，本文以Cu、Cd为胁迫因子，利用转录组测序技术研究在不同浓度的Cu（0.01 mg/L、0.5 mg/L和1 mg/L）、Cd（0.005 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L）胁迫下双齿围沙蚕的差异表达基因。分析结果显示，6个处理组共有的差异表达基因有101条，Cu 处理组共有99个差异表达基因，Cd 处理组共有42个差异表达基因；Cu、Cd处理组差异表达基因均在谷胱甘肽代谢、过氧化物酶体、细胞色素P450对外源物质代谢、ABC转运蛋白等通路显著富集（P < 0.05），表明这几条通路在双齿围沙蚕响应Cu、Cd胁迫的抗逆过程中起到重要作用。同时，本研究筛选出CYP4f4、CYP1A4、Cyp3a25、CYP2B4、cyp17a1、Cyp4f14等响应重金属Cu、Cd胁迫的抗性基因。本研究结果揭示了Cu、Cd胁迫对双齿围沙蚕在基因层面上的影响和差异，为深入研究双齿围沙蚕响应重金属胁迫的分子机制以及抗性基因筛选和克隆提供数据支持和理论参考。
Abstract:In order to explore the mechanism of response to heavy metal stress of Perinereis aibuhitensis, copper and cadmium were used as stress factors, and transcriptome sequencing technology was used to study the gene expression differences of Perinereis aibuhitensis under the stress of different concentrations of copper (0.01 mg/L, 0.5 mg/L, 1 mg/L) and cadmium (0.005 mg/L, 0.25 mg/L, 0.5 mg/L). The analysis showed that there were 101 differently expressed genes in the six treatment groups, 99 differently expressed genes in the Cu treatment group and 42 differently expressed genes in the Cd treatment group; the differentially expressed genes in the Cu and Cd treatment groups were significantly enriched (P < 0.05) in the glutathione metabolism, peroxisome, Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450, and ABC transporter protein pathways. These pathways play an important role in the response to Cu and Cd stresses in the Perinereis aibuhitensis. CYP4f4, CYP1A4, Cyp3a25, CYP2B4, cyp17a1 and Cyp4f14 were screened for resistance genes in response to heavy metal Cu and Cd stresses in this study. The results of this study reveal the effects and differences of Cu and Cd stress on Perinereis aibuhitensis at the genetic level, and provide data support and theoretical reference for the in-depth study of the molecular mechanisms of Perinereis aibuhitensis in response to heavy metal stress and the screening and cloning of resistance genes.
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Keywords:
- copper /
- cadmium /
- Perinereis aibuhitensis /
- transcriptome sequencing
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沿海地区作为人口和经济活动的聚集区，大量污染物随着人类活动直接或间接排入港口、海湾和海洋，使得近海生态环境压力不断加大。重金属是近岸海域环境中主要的污染物，具有分布范围广、持续时间长、不易在物质循环和能量交换中分解、被生物体富集沿食物链传递等特点，对人体危害极大[1]。海水中的重金属含量较低，绝大部分会被悬浮颗粒物吸附进入沉积物中，所以，沉积物被认为是海洋环境中重金属的积蓄地[2]。
近年来，转录组测序技术被广泛应用于动植物逆境响应机制的研究。叶晟[3]利用转录组测序技术研究Cd2+胁迫下文蛤（Meretrix meretrix）的响应机制，找到了细胞色素P450（cytochrome P450, CYP450）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GPX）、谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferase, GST）、热休克蛋白70、过氧化氢酶（Catalase, CAT）、铜/锌超氧化物歧化酶等对Cd2+有明显响应的6个功能基因；Jiao等[4]研究发现，Fe3+胁迫下的克氏原螯虾（Procambarus clarkii）谷胱甘肽代谢过程显著表达，在解毒过程中起到了重要作用；Zhang等[5]研究Cd2+胁迫下的中国蛤蜊（Mactra chinensis），发现热休克蛋白22、细胞色素P450、硫氧还蛋白过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶A、过氧化物酶1和锰超氧化物歧化酶等6个相关功能基因；Tang等[6]研究Cu2+胁迫下克氏原螯虾（Procambarus clarkii）差异表达基因，发现在过氧化物酶体通路中铜/锌超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、异柠檬酸脱氢酶[NAPD（+）] 1、植烷酰辅酶A 2羟化酶和 2, 4-二烯丙基辅酶A还原酶等5个基因在氧化应激反应中发挥重要作用。
双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）属于环节动物门多毛纲沙蚕科围沙蚕属，广泛分布于我国沿海地区，栖息于潮间带底质沉积物中，是海洋底栖生物类群的主要物种之一。以往的研究表明，沙蚕对重金属等各种污染物表现出很强的敏感性，因此经常被作为生态监测的指示生物[7]。在污染严重的地区，双齿围沙蚕能表现出相较于其他海洋无脊椎动物更强的耐受性和适应性，有研究认为双齿围沙蚕的这种对重金属的耐受性是可遗传的[8]。近年来，关于重金属对双齿围沙蚕的毒性效应研究主要集中在生理生化方面。研究发现，重金属胁迫下沙蚕体内会产生大量内源性活性氧（Reactive oxygen species，ROS），诱导激活抗氧化系统，其体内过氧化氢酶、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶（Peroxidase, POD）等抗氧化酶活性以及乙酰胆碱脂酶（Acetylcholinesterase, AChE）活性、金属硫蛋白（Metallothionein, MT）和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量等都在一定程度上被诱导激活[9-13]。沙蚕的逆境胁迫保护机制必然伴随着自身转录组的响应调控，目前利用转录组学研究双齿围沙蚕响应逆境胁迫调控机制的研究很少。因此，本研究以双齿围沙蚕为研究对象，利用RNA-seq技术，在转录组学方面探讨Cu、Cd 胁迫下沙蚕的分子响应机制，揭示沙蚕响应Cu、Cd 胁迫的差异基因与代谢通路，为环境污染监测的生物标记指示物筛选提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验所需的双齿围沙蚕购买于三亚五洲渔具店。将沙蚕置于装有以浓缩海晶配制的盐度为30的人工海水的不透明箱（66 cm × 54 cm × 36.5 cm）中避光暂养5 d，室温25 ℃，每隔24 h换水一次。暂养期间以鱼粉作为饵料，按10 g∶1 L的比例与海水混匀，于换水前临时配制。适应培养结束后，筛选体长10～13 cm、活力良好、形态完整的双齿围沙蚕进行胁迫实验，实验期间不添加饵料。
用CuSO4 （AR，购于西陇科学股份有限公司）和CdCl2 （AR，购于天津福晨化学试剂厂）作为Cu和Cd的来源，分别配制浓度为500 mg/L的储备液，使用时按比例稀释使用。
1.2 胁迫实验
参考《渔业水质标准》（GB 11607－89），本研究选择按照标准最高限值（Cu2+ = 0.01 mg/L，Cd2+ = 0.005 mg/L）的1、50、100倍设置实验浓度，Cu浓度分别为0.01 mg/L、0.5 mg/L和1 mg/L；Cd浓度分别为0.005 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L；按照以上浓度配制相应的人工海水用于沙蚕胁迫培养，同时设置空白对照组，共7个处理组，每组按照处理方式和处理浓度进行命名（如Cu处理0.01 mg/L浓度组命名为Cu 0.01），每组设置3个重复。以250 mL锥形瓶为培养容器，每个瓶中培养一只沙蚕，使用配制的人工海水于室温25 ℃ 下避光进行胁迫实验，每隔24 h更换一次人工海水，培养3 d后，用灭菌剪刀剪取沙蚕距头部3～4 cm处体节组织，剪碎，收集至2 mL冻存管中，置于液氮中冷却2 h后，移入−80 ℃冰箱保存。
冻存的样品寄往合肥麟美生物科技有限公司进行RNA提取以及转录组测序工作，测序平台为Illumina Hiseq 2500，得到的原始序列数据以FASTQ格式文件储存。
1.3 沙蚕体内重金属的测定
沙蚕体内重金属含量测定方法参照《海洋监测规范 第6部分：生物体分析》（GB 17378.6－2007）进行实验。
Cu处理组：取0.20 g沙蚕样品于50 mL烧杯中，加入2 mL硝酸，盖上表面皿，在电热板上低温加热至泡沫基本消失，取下烧杯，缓慢加入0.5 mL过氧化氢，盖上表面皿，于电热板上160 ℃～200 ℃条件下加热2 min左右，补加1 mL过氧化氢，继续加热并蒸发至约1 mL，加1 mL硝酸和1.5 mL过氧化氢，盖上表面皿，于电热板上160 ℃～200 ℃条件下蒸发至约0.5 mL，冷却后，全量移入10 mL具塞比色管中，加水至标线，混匀。
Cd处理组：取2.000 g沙蚕样品于100 mL烧杯中，加入4 mL硝酸，盖上表面皿，在电热板上低温加热至无气泡产生，冷却后加入2 mL硝酸和4 mL高氯酸，再加热至溶液呈透明淡黄色，移开表面皿蒸发至白烟冒尽，残留物用10 mL盐酸加热溶解，冷却后，全量转入25 mL具塞比色管中，用水稀释至标线。
制备好的消化液使用火焰原子吸收光谱仪分别在324.7 nm和228.8 nm波长下进行测定。
计算公式如下：
$$ \omega =C \cdot V/M $$ 式中：ω为生物体中Cu、Cd的含量（mg/kg）；C为测得的金属浓度（μg/mL）；V为样品消化液的体积（mL）；M为样品的称取量（g）。
1.4 差异表达基因筛选及功能注释
测序后原始数据使用cutadapt去除测序接头，使用fqtrim过滤掉不合格的序列后得到高质量的clean reads。使用Trinily软件进行De novo拼接得到转录本，并采用RSeQC软件冗余序列，得到Unigenes。得到的Unigenes利用DIAMOND软件进行功能注释。使用Salmon 软件对基因表达水平进行定量分析，用R语言程序包edgeR进行差异表达基因（differently expressed genes，DEGs）筛选，以P值（P value）和差异倍数（fold change，FC）为标准，将P < 0.05、│log2FC│>1的基因定义为显著差异表达基因。根据基因本体数据库（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）注释结果，使用R软件包中的phyper函数进行差异基因GO、KEGG富集分析。
1.5 qRT-PCR验证
选取6个基因，采用Premier5设计引物，选择Actin作为内参基因进行实时荧光定量PCR，每个样品进行3次技术重复，确保结果的可靠性和准确性。
2 结果与讨论
2.1 沙蚕体内重金属含量
如图1所示，Cu处理组和Cd处理组中重金属含量均高于对照组。前人的研究已经发现，在一定浓度范围Cu、Cd暴露下，Cu和Cd会在沙蚕体内大量积累[14]。Cu 0.01、Cu 0.5处理组和Cd 0.005、Cd 0.25处理组结果相近。造成这种结果的原因可能是本实验选取的暴露浓度较低，所以组间沙蚕体内富集的重金属含量差异不明显。整体来看，沙蚕对Cu、Cd的富集能力随暴露浓度升高而变强。
2.2 转录组测序数据统计与质量评估
测序下机后共获得322 078 324条序列，对其进行质量剪切后共获得316 060 220条序列，其中每组测序前后的Q20（序列质量大于20的碱基数的比例）、Q30（序列质量大于30的碱基数的比例）和GC（序列中G、C含量的占比）分别为98.22%～98.66%、94.67%～95.32%、42.93%～45.07%（表1），说明低质量碱基比率较低，测序质量较好。
表 1 测序数据统计Tab. 1 Statistical table of sequencing data样本名称 原始数据/bp Q20/（%） Q30/（%） GC/（%） 质量剪切后数据/bp Q20/（%） Q30/（%） GC/（%） Cu 0.01 48 391 724 98.25 94.77 44.15 47 533 064 98.61 95.18 43.83 Cu 0.5 44 955 388 98.25 94.78 43.59 44 142 488 98.61 95.20 43.22 Cu 1 45 178 362 98.30 94.90 45.07 44 234 262 98.66 95.32 44.74 Cd 0.005 50 422 882 98.22 94.67 43.55 49 333 114 98.57 95.07 43.08 Cd 0.25 45 172 626 98.27 94.76 43.35 44 389 096 98.60 95.15 42.98 Cd 0.5 48 458 546 98.28 94.81 43.93 47 546 628 98.61 95.20 43.56 对照组 39 498 796 98.25 94.74 43.26 38 881 568 98.59 95.13 42.93 2.3 基因差异表达分析
以│log2FC│>1、P < 0.05为筛选条件，6个处理组DEGs 如表2所示，其中Cd 0.5处理组 DEGs 数量最少（2420个），其中1287个 DEGs 上调表达，1133个 DEGs 下调表达，与另外两个Cd 处理组相差较大。整体来看，Cu、Cd 处理组的 DEGs 数量随着重金属暴露浓度升高呈现一定的下降趋势。本研究中，6个处理组共有101个DEGs ，仅占DEGs总数的0.5%， 在Cu处理组中独有的DEGs有99个，在Cd处理组中独有的DEGs有42个（图2）。将差异表达基因进行聚类分析，发现Cu 0.01和Cd 0.005、Cu 0.5和Cd 0.25、Cu 1和Cd 0.5两两处理组之间具有相近的表达模式，且表达的差异随处理浓度的升高而变大（图3）。以上结果说明，在分子层面上Cu和Cd的毒性机理总体来说仍有较大的区别。
表 2 差异表达基因统计Tab. 2 Statistical table of differentially expressed genes对照分组 P < 0.05,│log2FC│> 1 上调 下调 总计 Cu 0.01 vs 对照组 1870 1797 3667 Cu 0.5 vs 对照组 1575 2082 3657 Cu 1 vs 对照组 1957 1453 3410 Cd 0.005 vs 对照组 1559 2004 3563 Cd 0.25 vs 对照组 1620 1895 3515 Cd 0.5 vs 对照组 1287 1133 2420 如表3所示，在6个处理组共表达的101个DEGs中筛选出部分与生物解毒代谢有关的基因，包括CAT、SOD1、GPX1、谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase）基因gss、谷胱甘肽S-转移酶ω1（glutathione S-transferase omega 1）基因GSTO1、微粒体谷胱甘肽S-转移酶1（microsomal glutathione S-transferase 1）基因Mgst1、谷胱甘肽S-转移酶1（glutathione S-transferase 1）基因GST1以及细胞色素P450家族基因Cyp3a25等。CAT、SOD1、GPX1的差异表达说明，在重金属胁迫下，CAT、SOD、GPX等抗氧化酶在抵抗重金属产生的毒性过程中发挥重要作用，该结果在前人的研究中也得到证实[9-14]。
表 3 部分差异基因功能Tab. 3 Function of partial differential expressed genes基因名称 基因功能 变化组别 变化趋势 GST1 谷胱甘肽-S-转移酶，细胞色素P450对外源物质代谢 Cu 上调 GSTO1 谷胱甘肽-S-转移酶ω1，细胞色素P450对外源物质代谢 Cu 上调 Mgst1 微粒体谷胱甘肽-S-转移酶1，细胞色素P450对外源物质代谢 Cu、Cd 下调 GPX1 谷胱甘肽过氧化物酶1，谷胱甘肽代谢 Cu、Cd 上调 GPX3 谷胱甘肽过氧化物酶3，谷胱甘肽代谢 Cu 下调 gss 谷胱甘肽合成酶，谷胱甘肽代谢 Cu 下调 Cd 上调 CAT 过氧化氢酶，过氧化物酶体 Cu、Cd 上调 SOD1 超氧化物歧化酶 1，过氧化物酶体 Cu、Cd 上调 CYP4f4 细胞色素P450家族4亚家族F，细胞色素P450 Cu 上调 CYP1A4 细胞色素P450家族1亚家族A，细胞色素P450 Cu 下调 Cyp3a25 细胞色素P450家族3亚家族A，细胞色素P450 Cu、Cd 上调 CYP2B4 细胞色素P450家族2亚家族B，细胞色素P450 Cd 上调 cyp17a1 细胞色素P450家族17亚家族A成员1，细胞色素P450 Cd 上调 Cyp4f14 细胞色素P450家族4亚家族F，细胞色素P450 Cd 下调 CYP450属于生物转化酶Ⅰ相酶，GST是生物转化酶Ⅱ相酶的一种，也是主要的抗氧化酶之一，它们共同参与生物体代谢途径，调节内外源物质相互转化，在生物解毒功能方面发挥重要的作用[15-18]。本研究中，GST1、GSTO1基因在Cu处理组中显著表达，Mgst1基因在Cu、Cd处理组均显著表达。李长春[19]的研究发现，Cd胁迫下拟环纹豹蛛（Pardosa pseudoannulata）GST基因显著上调表达，与本研究的结果相似。本研究中，Cyp3a25基因在Cu、Cd处理组中均显著表达，在Cu处理3个实验组中均显著差异表达的有CYP4f4和CYP1A4基因，在Cd处理3个实验组均显著差异表达的有CYP2B4、cyp17a1和Cyp4f14基因。郑志琴[20]的研究发现，青海钩虾（Gammarus suifunensis）中Gs-CYP2J2、Gs-CYP18a1、Gs-CYP4c3、Gs-CYP49a1和Gs-CYP3a24基因的表达与CdCl2胁迫程度有关。王莹[21]的研究表明，重金属Cu胁迫刺激了斜纹夜蛾（Spodoptera litura）的CYP6AB12和CYP6B50基因的表达以及CYP450酶活的上调。综上所述，沙蚕CYP450相关基因的表达会受到重金属Cu、Cd的影响。李春杰等[22]建立的CYP3A65荧光标记转基因斑马鱼模型可以用于环境中Cu、Cd、Zn和PCB126等污染物的检测，说明沙蚕的Cyp3a25、CYP4f4、CYP1A4、CYP2B4、cyp17a1和Cyp4f14基因也有可能作为潜在的生物分子标记用于环境重金属Cu、Cd的监测。
2.4 GO功能注释富集分析
将差异基因在GO数据库中注释，并进行分类和富集分析。如图4所示，Cu胁迫组和Cd胁迫组的DEGs富集结果十分相似。在生物过程中，DEGs在氧化还原过程（oxidation−reduction process）、蛋白水解（proteolysis）富集最多；在细胞组分中，细胞质（cytoplasm）、膜组成部分（integral component of membrane）、细胞核（nucleus）、细胞质膜（plasma membrane）的DEGs占比较高；在分子功能类型中，金属离子结合（metal ion binding）、ATP结合（ATP binding）、蛋白结合（protein binding）富集的DEGs较多，这些GO条目说明Cu、Cd胁迫对沙蚕细胞膜、蛋白分子结构产生了影响，与重金属致毒机理相符合。此外，Cd处理组DEGs显著富集的GO条目还有生物过程中的神经肽信号传导途径（neuropeptide signaling pathway）、突触传递胆碱酯酶（synaptic transmission, cholinergic）；细胞组分中的乙酰胆碱门控通道复合物（acetylcholine-gated channel complex）；分子功能中的乙酰胆碱受体活性（acetylcholine receptor activity）、乙酰胆碱结合（acetylcholine binding），等等。AChE 是神经兴奋传导的关键酶，Cd暴露会抑制AChE的活性[23]。有研究发现，Cd暴露会抑制斑马鱼不同组织中AChE活性，损伤神经细胞，甚至会影响F1代神经递质的代谢，产生发育性神经毒性损伤[24]。本研究中，Cd处理组DEGs富集到多个关于神经信号传导的GO条目，推测Cd暴露引起了沙蚕神经信号传导功能的紊乱，从而引起沙蚕神经毒性损伤。
2.5 KEGG功能注释和富集分析
基因的转录是调控生物过程必不可少的方式，因而本研究将6个处理组的DEGs进行KEGG富集分析，富集部分通路如表4所示。6个处理组的DEGs一共显著富集（P < 0.05）到39个通路中，其中Cu 0.01组显著变化通路有10个，Cu 0.5组显著变化通路有14个，Cu 1组显著变化通路有15个，Cu处理中3个实验组均在谷胱甘肽代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、DNA复制（DNA replication）、过氧化物酶体、细胞周期（Cell cycle）、ABC转运蛋白（ABC transporters）通路显著变化；Cd 0.005组显著变化通路有26个，Cd 0.25组显著变化通路有16个Cd 0.5组显著变化通路有16个，Cd处理中3个实验组均在谷胱甘肽代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、过氧化物酶体、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（Glycine, serine and threonine metabolism）、ABC转运蛋白、胆汁分泌（Bile secretion）通路显著变化。其中Cu、Cd处理组均在谷胱甘肽代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、过氧化物酶体、ABC转运蛋白通路显著变化。
表 4 暴露组DEGs富集的基因通路（P < 0.05）Tab. 4 Function pathways of DEGs in exposure groups （P < 0.05）通路名称 通路编号 差异表达基因数量 Cu 0.01 Cu 0.5 Cu 1 Cd 0.005 Cd 0.25 Cd 0.5 果糖和甘露糖代谢 map 00051 — — — 9 — — 类固醇生物合成 map 00100 — — 6 — 7 — 初级胆汁酸生物合成 map 00120 — — — — — 4 类固醇激素的生物合成 map 00140 — 14 — 11 — — 精氨酸生物合成 map 00220 — — — 8 — — 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 map 00250 — 13 — — — — 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 map 00260 13 — — 12 13 8 精氨酸和脯氨酸代谢 map 00330 — — — 12 — 9 酪氨酸代谢 map 00350 9 — — — — — 苯丙氨酸代谢 map 00360 7 — — — — — 色氨酸代谢 map 00380 — — 11 — — 7 磷酸盐和磷酸盐代谢 map 00440 — — — — 4 — 谷胱甘肽代谢 map 00480 11 24 20 13 12 8 糖胺聚糖降解 map 00531 — — 8 — — 7 色氨酸代谢 map 00380 — — 11 — — 7 磷酸盐和磷酸盐代谢 map 00440 — — — — 4 — 谷胱甘肽代谢 map 00480 11 24 20 13 12 8 糖胺聚糖降解 map 00531 — — 8 — — 7 醚类脂代谢 map 00565 10 — — — — — 花生四烯酸代谢 map 00590 — — 12 — — 9 叶酸生物合成 map 00790 — — — — 8 7 视黄醇代谢 map 00830 — 16 — 13 — 7 氮代谢 map 00910 — — — 6 — 4 氨酰- tRNA生物合成 map 00970 19 17 — 21 18 — 细胞色素P450对外源物质的代谢 map 00980 8 19 14 13 11 8 药物代谢-细胞色素P450 map 00982 — 18 15 12 — — 药物代谢-其他酶 map 00983 — — 22 16 — 10 铂耐药 map 01524 — — 14 — 15 — ABC转运蛋白 map 02010 4 6 5 3 5 2 DNA复制 map 03030 14 19 16 19 19 — 底座切除修复 map 03410 — 13 — 13 12 — 错配修复 map 03430 — — — 8 8 — 同源重组 map 03440 — — — 10 — — 范可尼贫血途径 map 03460 — 17 — — 12 — 神经活性配体-受体相互作用 map 04080 — — 15 16 — — 细胞周期 map 04110 21 32 25 22 28 — 溶酶体 map 04142 — — 23 — — 15 过氧化物酶体 map 04146 18 19 10 16 12 7 EMC-受体相互作用 map 04512 — — — 13 — — 补体和凝血级联 map 04610 — — — 6 — — 蛋白质的消化和吸收 map 04974 — — — 14 — — 胆汁分泌 map 04976 — 20 — 20 16 11 维生素的消化和吸收 map 04977 — — — 9 — — 研究表明，过氧化物酶体可以通过参与脂肪酸β-氧化过程产生ROS，同时也可以通过SOD将O2−催化产生H2O2，最后通过CAT将H2O2还原成H2O[25-27]。本研究中，Cu、Cd处理组CAT和SOD1基因均在过氧化物酶体通路富集，此外Cu处理组在脂肪酸β-氧化过程富集多个显著下调表达的基因。
谷胱甘肽代谢通路参与氧化应激的主要是GST和GPX，它们在细胞解毒和保护组织免受氧化损伤等方面发挥关键作用[28-29]。还有研究表明，GST可以通过催化谷胱甘肽与毒性物质的结合，选择性地被ABC转运蛋白转移出细胞来降低细胞毒性[30]。本研究中，Cu、Cd处理组均在谷胱甘肽代谢和细胞色素P450对外源物质代谢通路显著富集，ABC转运蛋白在Cd处理组显著富集。在Cd处理虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）后的消化腺转录组测序结果中也得出了相似的结果[17]。
2.6 qRT-PCR验证
为验证RNA-seq结果准确性，在筛选出的差异基因中随机选取6个基因进行实时荧光定量PCR验证，基因信息和所用引物序列如表5所示。将实时荧光定量PCR结果与转录组测序结果比较，这6个基因的RNA-seq结果与qRT-PCR结果表达趋势基本一致，说明转录组测序结果可靠（图5）。
表 5 6个基因信息及引物序列Tab. 5 six genes information and the primer sequence编号 基因编号 引物序列 sc1 TRINITY_DN19204_c0_g1 F: CTGCTTGGAGGATCACCGTT R: TGCTCCTCCTCCTCTTCCTC sc2 TRINITY_DN19216_c1_g1 F: TTTCACCGACAGGACTTCGC R: GCACGAGACCTTCACACTGT sc3 TRINITY_DN18170_c1_g6 F: GTATGCTCACCCCCATCGAG R: CTCTTCCGTGGTGTTGACGA sc4 TRINITY_DN18170_c1_g5 F: GACACGCTGATCGCCATAGA R: AATGGAAGCGTGTCCTCCTG sc5 TRINITY_DN23184_c0_g1 F: GTGACCAAAGCAAGTGCCTG R: ACCATCCCATTGCCACAGAG sc6 TRINITY_DN20397_c0_g2 F: TGGCGTTCAATGGCAAACTG R: CAGTCGGACGTGTGAGTGAA 3 结 论
（1）在较低浓度的Cu、Cd暴露下，双齿围沙蚕对重金属仍有较强的富集能力，且富集量随暴露浓度升高而增加。
（2）转录组数据分析表明，在Cu、Cd胁迫下，双齿围沙蚕差异基因主要富集于过氧化物酶体、细胞色素P450对外源物质的代谢、谷胱甘肽代谢、ABC转运蛋白通路。这些通路在沙蚕对重金属Cu、Cd的解毒代谢和抗氧化过程中起主要调控作用。
（3）通过对DEGs进行筛选，本研究发现Cyp3a25、CYP4f4、CYP1A4、CYP2B4、cyp17a1和Cyp4f14等CYP450基因分别在双齿围沙蚕抵抗重金属Cu、Cd胁迫时发挥重要作用，可作为双齿围沙蚕响应Cu、Cd胁迫的生物分子标记，其具体作用机制值得进一步研究。
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表 1 测序数据统计
Tab. 1 Statistical table of sequencing data
样本名称 原始数据/bp Q20/（%） Q30/（%） GC/（%） 质量剪切后数据/bp Q20/（%） Q30/（%） GC/（%） Cu 0.01 48 391 724 98.25 94.77 44.15 47 533 064 98.61 95.18 43.83 Cu 0.5 44 955 388 98.25 94.78 43.59 44 142 488 98.61 95.20 43.22 Cu 1 45 178 362 98.30 94.90 45.07 44 234 262 98.66 95.32 44.74 Cd 0.005 50 422 882 98.22 94.67 43.55 49 333 114 98.57 95.07 43.08 Cd 0.25 45 172 626 98.27 94.76 43.35 44 389 096 98.60 95.15 42.98 Cd 0.5 48 458 546 98.28 94.81 43.93 47 546 628 98.61 95.20 43.56 对照组 39 498 796 98.25 94.74 43.26 38 881 568 98.59 95.13 42.93 
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表 2 差异表达基因统计
Tab. 2 Statistical table of differentially expressed genes
对照分组 P < 0.05,│log2FC│> 1 上调 下调 总计 Cu 0.01 vs 对照组 1870 1797 3667 Cu 0.5 vs 对照组 1575 2082 3657 Cu 1 vs 对照组 1957 1453 3410 Cd 0.005 vs 对照组 1559 2004 3563 Cd 0.25 vs 对照组 1620 1895 3515 Cd 0.5 vs 对照组 1287 1133 2420
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表 3 部分差异基因功能
Tab. 3 Function of partial differential expressed genes
基因名称 基因功能 变化组别 变化趋势 GST1 谷胱甘肽-S-转移酶，细胞色素P450对外源物质代谢 Cu 上调 GSTO1 谷胱甘肽-S-转移酶ω1，细胞色素P450对外源物质代谢 Cu 上调 Mgst1 微粒体谷胱甘肽-S-转移酶1，细胞色素P450对外源物质代谢 Cu、Cd 下调 GPX1 谷胱甘肽过氧化物酶1，谷胱甘肽代谢 Cu、Cd 上调 GPX3 谷胱甘肽过氧化物酶3，谷胱甘肽代谢 Cu 下调 gss 谷胱甘肽合成酶，谷胱甘肽代谢 Cu 下调 Cd 上调 CAT 过氧化氢酶，过氧化物酶体 Cu、Cd 上调 SOD1 超氧化物歧化酶 1，过氧化物酶体 Cu、Cd 上调 CYP4f4 细胞色素P450家族4亚家族F，细胞色素P450 Cu 上调 CYP1A4 细胞色素P450家族1亚家族A，细胞色素P450 Cu 下调 Cyp3a25 细胞色素P450家族3亚家族A，细胞色素P450 Cu、Cd 上调 CYP2B4 细胞色素P450家族2亚家族B，细胞色素P450 Cd 上调 cyp17a1 细胞色素P450家族17亚家族A成员1，细胞色素P450 Cd 上调 Cyp4f14 细胞色素P450家族4亚家族F，细胞色素P450 Cd 下调
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表 4 暴露组DEGs富集的基因通路（P < 0.05）
Tab. 4 Function pathways of DEGs in exposure groups （P < 0.05）
通路名称 通路编号 差异表达基因数量 Cu 0.01 Cu 0.5 Cu 1 Cd 0.005 Cd 0.25 Cd 0.5 果糖和甘露糖代谢 map 00051 — — — 9 — — 类固醇生物合成 map 00100 — — 6 — 7 — 初级胆汁酸生物合成 map 00120 — — — — — 4 类固醇激素的生物合成 map 00140 — 14 — 11 — — 精氨酸生物合成 map 00220 — — — 8 — — 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 map 00250 — 13 — — — — 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 map 00260 13 — — 12 13 8 精氨酸和脯氨酸代谢 map 00330 — — — 12 — 9 酪氨酸代谢 map 00350 9 — — — — — 苯丙氨酸代谢 map 00360 7 — — — — — 色氨酸代谢 map 00380 — — 11 — — 7 磷酸盐和磷酸盐代谢 map 00440 — — — — 4 — 谷胱甘肽代谢 map 00480 11 24 20 13 12 8 糖胺聚糖降解 map 00531 — — 8 — — 7 色氨酸代谢 map 00380 — — 11 — — 7 磷酸盐和磷酸盐代谢 map 00440 — — — — 4 — 谷胱甘肽代谢 map 00480 11 24 20 13 12 8 糖胺聚糖降解 map 00531 — — 8 — — 7 醚类脂代谢 map 00565 10 — — — — — 花生四烯酸代谢 map 00590 — — 12 — — 9 叶酸生物合成 map 00790 — — — — 8 7 视黄醇代谢 map 00830 — 16 — 13 — 7 氮代谢 map 00910 — — — 6 — 4 氨酰- tRNA生物合成 map 00970 19 17 — 21 18 — 细胞色素P450对外源物质的代谢 map 00980 8 19 14 13 11 8 药物代谢-细胞色素P450 map 00982 — 18 15 12 — — 药物代谢-其他酶 map 00983 — — 22 16 — 10 铂耐药 map 01524 — — 14 — 15 — ABC转运蛋白 map 02010 4 6 5 3 5 2 DNA复制 map 03030 14 19 16 19 19 — 底座切除修复 map 03410 — 13 — 13 12 — 错配修复 map 03430 — — — 8 8 — 同源重组 map 03440 — — — 10 — — 范可尼贫血途径 map 03460 — 17 — — 12 — 神经活性配体-受体相互作用 map 04080 — — 15 16 — — 细胞周期 map 04110 21 32 25 22 28 — 溶酶体 map 04142 — — 23 — — 15 过氧化物酶体 map 04146 18 19 10 16 12 7 EMC-受体相互作用 map 04512 — — — 13 — — 补体和凝血级联 map 04610 — — — 6 — — 蛋白质的消化和吸收 map 04974 — — — 14 — — 胆汁分泌 map 04976 — 20 — 20 16 11 维生素的消化和吸收 map 04977 — — — 9 — —
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表 5 6个基因信息及引物序列
Tab. 5 six genes information and the primer sequence
编号 基因编号 引物序列 sc1 TRINITY_DN19204_c0_g1 F: CTGCTTGGAGGATCACCGTT R: TGCTCCTCCTCCTCTTCCTC sc2 TRINITY_DN19216_c1_g1 F: TTTCACCGACAGGACTTCGC R: GCACGAGACCTTCACACTGT sc3 TRINITY_DN18170_c1_g6 F: GTATGCTCACCCCCATCGAG R: CTCTTCCGTGGTGTTGACGA sc4 TRINITY_DN18170_c1_g5 F: GACACGCTGATCGCCATAGA R: AATGGAAGCGTGTCCTCCTG sc5 TRINITY_DN23184_c0_g1 F: GTGACCAAAGCAAGTGCCTG R: ACCATCCCATTGCCACAGAG sc6 TRINITY_DN20397_c0_g2 F: TGGCGTTCAATGGCAAACTG R: CAGTCGGACGTGTGAGTGAA
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