海月水母（Aurelia coerulea）是我国海域大型水母优势种之一，近年来常在近海聚集性暴发，给海洋渔业、旅游业、工业等带来巨大经济损失^[1-2]。海月水母生活史包括两个阶段：营底栖附着生活的螅状体阶段和营浮游生活的水母体阶段。螅状体通过出芽生殖产生子代螅状体，也可通过横裂生殖产生碟状体，碟状体进一步发育长成水母体^[3]。

海月水母具有多种无性繁殖方式和灵活的繁殖策略，保证其适应环境条件的改变并在环境适宜时大量繁殖子代个体。海月水母无性繁殖方式多达7种，包括出芽生殖（budding）、匍匐茎生殖（reproduction from parts of stolons）、足囊生殖（podocyst formation）、内繁殖体生殖（internal production of free-swimming propagules）、外繁殖体生殖（external production of free-swimming propagules）、纵向分裂（longitudinal fission）和横裂生殖（strobilation）^[4]。温度、食物、光照、溶解氧等被认为是影响海月水母无性生殖的关键因子^[5-6]。

除生理生态观察实验外，研究者也开始尝试利用转录组等分子生物学技术探索海月水母生活史不同阶段转换的内在机制。转录组测序分析表明，编码维生素A酸（RA）受体的RxR基因在海月水母螅状体横裂期明显上调表达，推测RA可能是连接温度感应受体（temperature sensing receptor）和诱发下游横裂变态基因的中间环节；CL390基因可以编码横裂生殖激素（stroblation hormone）的先导物，进而诱发海月水母的横裂生殖^[7]。低温处理下细胞外分泌蛋白信号通路（wingless-int，Wnt）被抑制，转化生长因子信号通路（transforming growth factor beta, TGF-β）、丝裂原活化蛋白激酶信号通路（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和细胞周期信号通路（Cell Cycle）被激活^[8]。

本文以海月水母为研究对象，对不同食物水平下的螅状体进行转录组分析，筛选差异表达基因，研究差异基因富集的通路，探讨海月水母无性繁殖策略的分子机制，为探索我国灾害性水母暴发的原因与防治提供科学依据。

1   材料与方法

1.1   海月水母螅状体的培养

实验所用海月水母螅状体由中国科学研究院海洋研究所提供，保存于中国海洋大学环境科学与工程学院赤潮分子检测实验室。培养温度为（18.5±0.5）℃，盐度为34.1。15 ℃是海月水母螅状体出芽和横裂生殖的关键节点^[9]。本实验在15 ℃下，设置3个不同的食物水平（低食物组F1：25个卤虫/组/2天；中食物组F2：250个卤虫/组/2天；高食物组F3：1000个卤虫/组/2天），每组设置3个生物学重复。

将附着有水螅体的波纹板统一裁剪为大小相同的正方形（2 cm×2 cm），留取生长状态良好且大小基本相同（约1 mm）的水螅体（每板5只），将其置于250 mL的玻璃烧杯中，培养水体为150 mL。实验前将放有水螅体的烧杯分别置于15 ℃培养箱中，在黑暗条件下培养7天，不投喂饵料。实验过程中培养箱内保持黑暗状态。食物量采用密度法控制，即用所需食物个数除以1 mL悬浮液里卤虫无节幼虫的个数得出所需食物体积。用移液器吸取一定体积的所需食物并对准螅状体喂食。每两天喂食一次，喂食半小时后更换烧杯中的海水。实验过程中产生的子代螅状体及足囊用解剖针剔除，游离的碟状体用吸管清除。每天利用解剖镜观察并记录水螅体的无性繁殖，实验周期为50天。

1.2   提取RNA与文库构建

实验周期为50天，此时横裂生殖基本结束。实验结束时，将每组的5只水螅体收集至冻存管中，液氮冷冻保存，用于RNA的提取。每个实验组的3个平行样品分别用于提取RNA，并上机分析。螅状体总RNA的提取采用酚−氯仿−异戊醇抽提法，具体参照谭树亮等的操作^[10]。样品送由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成测序（Illumina HiSeq 2000平台）。

1.3   转录本生物信息分析

测序数据采用无参转录组分析。转录本生物信息分析方法同参考文献[10]。

2   结果与讨论

2.1   不同食物水平对出芽繁殖的影响

在3个食物水平下，海月水母匍匐茎出芽和直接出芽的数量如图1所示。在15 ℃下，海月水母螅状体无性繁殖主要为匍匐茎出芽。F1、F2和F3组每组螅状体通过匍匐茎出芽产生的子代螅状体累积个数分别为26、32、58个。截至实验结束，高食物组（F3组），匍匐茎出芽产生的子代螅状体占子体总量的93.5%。低食物组（F1组），匍匐茎出芽生殖产生子代螅状体占子体总量的100%。高食物组（F3组）子代螅状体的数量显著高于F2组和F1组（P<0.05，Mann-Whitney U test），说明在充足的食物条件下螅状体主要进行匍匐茎出芽生殖。F2组与F1组通过匍匐茎出芽产生的子代数量无显著性差异（P>0.05，Mann-Whitney U test）。对于直接出芽生殖，低食物组中产生的子代个体为0，中、高食物组直到培养末期才有少量的子代个体产生，表明在15 ℃条件下食物无论是短缺还是充裕，直接出芽方式都不是海月水母螅状体的优先选择。子代螅状体能够利用匍匐茎出芽脱离母体，附着于远离母体的基质上^[11]，海月水母螅状体在生存环境适宜时通过匍匐茎出芽可最大程度地占据生存空间，形成种群效应。

图  1  不同食物水平对海月水母螅状体出芽繁殖的影响

Fig.  1  Effects of different food supplies on the budding reproduction of A. coerulea polyps

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2.2   不同食物水平对横裂生殖的影响

3个食物水平组的螅状体同时进入横裂间期（从横裂体出现到第一个碟状体释放的时期为横裂间期），横裂间期持续时间依次为F3组（8 d）>F2组（6 d）>F1组（4 d），食物越充足横裂间期持续时间越长。食物水平越高，螅状体最终释放碟状体的数量越多（图2）。F2组释放的碟状体数量在前期高于F3组，但F3组最终产生的碟状体数量最多。F2组和F3组释放的碟状体数量显著高于F1组（P<0.05，Mann-Whitney U test）。F2组和F3组之间无显著性差异（P>0.05，Mann-Whitney U test）。与本文研究结果相类似，徐盛楠^[12]发现投食组海月水母螅状体产生碟状体的数量明显多于饥饿组，而且饥饿组螅状体释放碟状体的时间早于投食组。当面临食物短缺时，海月水母螅状体通过尽快启动横裂生殖释放碟状体补充水母体数量，以摆脱栖息地的不良条件，这可能是其生存繁殖的策略之一。

图  2  不同食物水平对海月水母螅状体横裂生殖的影响

Fig.  2  Effects of different food supplies on strobilation of A. coerulea polyps

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2.3   海月水母无性繁殖的转录组结果

2.3.1   转录本拼接与注释

将clean reads用Trinity软件拼接完成之后，共获得449361条转录本，194278条unigenes，拼接后转录组unigenes的N50为1239 bp，平均长度为903 bp。在七大数据库中，转录本数据在NR数据库注释成功率最高，为42.82%。其次为GO、PFAM、SwissProt，注释成功率均接近39%。KO注释成功率最低，仅为20.93%。至少在一个数据库中注释成功的基因有115147条，注释成功率达到了59.26%。

与NR数据库的比对结果表明，本研究基因数据与近缘物种基因序列的相似性最高的物种是普通水螅（Hydra vulgaris），其次为明星海葵（Nematostella vectensis）、文昌鱼（Branchiostoma floridae）。GO数据库将注释成功的基因分为三大类，分别是生物学过程、细胞成分、分子功能，注释到这三个分类下面基因个数最多的条目依次是细胞过程、细胞部件、结合功能。将全部unigenes用于KOG比对注释，注释成功后分为26个组分，最多的功能归类于翻译、核糖体的结构和生物发生、翻译蛋白的修饰转换及结合、通用功能和信号转导机制。将基因参与的KEGG代谢通路进行分类，代谢途径根据已注释Unigenes数目由多到少依次为信号转导、翻译、运输和代谢等。

2.3.2   差异基因KEGG富集分析

以F2组为中等食物水平，分别统计其与低食物水平组（F1组）和高食物水平组（F3组）的差异表达基因（图3）。F1组（25个卤虫/组/2天）与F2组（250个卤虫/组/2天）相比，共有200个基因的表达水平出现显著上调，131个基因出现显著下调。与F2组相比，F3组（1000个卤虫/组/2天）共有44个基因出现显著上调，124个基因出现显著下调。

图  3  不同食物水平下海月水母螅状体基因差异表达分析火山图（A: F2组 vs F1组; B: F3组 vs F2组）

（横坐标代表基因在不同实验组中表达倍数变化；纵坐标代表基因表达量变化的统计学显著程度）

Fig.  3  Analysis of gene differential expression of A. coerulea polyps under different food supplies (A:F2 vs F1; B: F3 vs F2)

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以Rich factor、qvalue及Gene number来衡量富集程度，KEGG富集分析结果如图4所示。F1组与F2组相比，差异基因显著富集在氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）、心肌收缩（cardiac muscle contraction）上；F3组与F2组相比，差异基因显著富集在糖酵解/糖异生（glycolysis/gluconeogenesis）、组氨酸代谢（histidine metabolism）、甘油酯代谢（glycerolipid metabolism）、碳水化合物消化吸收（carbohydrate digestion and absorption）等途径。

图  4  不同食物水平下海月水母螅状体差异基因KEGG富集分析（A: F2组 vs F1组; B: F3组 vs F2组）

Fig.  4  KEGG enrichment analysis of differentially expressing genes of A. coerulea polyps under different food supplies (A: F2 vs F1; B: F3 vs F2)

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2.3.3   无性繁殖相关的富集信号通路

本研究的差异基因主要富集到两条与海月水母无性繁殖相关的信号通路，分别为MAPK信号通路和Cell cycle信号通路。通过KEEG富集分析，共有874个基因被注释到MAPK信号通路（图5）。MAPK是丝氨酸/苏氨酸激酶，可磷酸化转录因子和其他下游激酶，介导从细胞表面到细胞核的细胞信号转导，并负责许多生物活动和细胞过程，如增殖和分化^[13]。海月水母MAPK信号通路中主要有4条分支路线（ERK、JNK、p38/MAPK、ERK5）用以调控细胞生长和分化。其中，ERK主要负责细胞增殖分化；JNK和p38功能相似，与炎症、凋亡、生长有关。从图5可以看出，p38信号通路由三级激酶链组成，MKK3、MKK6是主要的上游激活物。JNK信号通路能被磷酸化的MKK4或MKK7激活，活化后的JNK可以调节多种转录因子。对水螅的研究表明，MAPK通路可以启动其受伤后细胞凋亡的补偿性代谢增殖，代表了一种启动再生过程的进化机制，MAPK通路对水螅头部再生起着至关重要的作用^[14]。

图  5  海月水母转录组中MAPK信号通路

（红色表示基因表达上调，蓝色表示基因表达下调）

Fig.  5  MAPK signaling pathway in the transcriptome of A. coerulea

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F1组与F2组相比，显著差异表达的基因共有两个，CACN（voltage-dependent calcium channel P/Q type alpha-1A，上调）和cMyc（Myc proto-oncogene protein，下调）；CACN全称为P/Q型钙通道α1A亚单位基因CACNA1A，在神经元发育、神经递质释放等方面发挥重要作用，在MAPK通路间接调控NFAT-2以及NFAT-4，而NFATs已被证实能够参加细胞的增殖分化^[15]，CACN基因上调不利于NFATs的积累，从而间接抑制海月水母的无性繁殖。c-Myc基因的表达与细胞增殖和分化有关^[16]，其下调表达不利于ERK、MAPK信号通路对于细胞分化的调控。F3组与F2组相比，差异表达的基因是FLNA（filamin，上调）和ECSIT（evolutionarily conserved signaling intermediate in Toll pathway，下调）。FLNA是一类支架蛋白，主要功能是协助调控JNK模块^[17]。FLNA上调有利于激活JNK途径，从而促进细胞的增殖分化。

Cell cycle通路处于MAPK通路的下游，其作用为控制细胞分裂周期。在Cell cycle通路中，最核心的调控因子是Cyclin（细胞周期蛋白）和CDK（细胞周期蛋白依赖性激酶）构成的复合物。海月水母体注释到与Cyclin有关的基因主要为CycA/B/D/E/H，与CDK有关的基因主要有CDK1/2/4/6/7。通过KEGG富集分析，转录组中共有527个基因被归到Cell cycle信号通路中（图6）。F1组与F2组相比，有两个基因出现显著上调，分别是14-3-3 protein beta/theta/zeta和SCF（S-phase kinase-associated protein 1），有1个基因（cMyc）出现下调。14-3-3蛋白被证实在哺乳动物中共有7种亚型（β, ε, η, γ, θ, σ和ζ），并且与生物体生长发育具有密切的联系^[18]。14-3-3蛋白作为一种细胞周期调控性蛋白，能与Cdc25C上磷酸活化点结合，抑制其活性，进而影响细胞周期的进程^[19]。14-3-3蛋白位于p53下游，对CDK2/cyclinE具有负调节作用，通过促进G1期阻滞从而阻止CDC2/cyclinB进入细胞质，因此导致G2期阻滞^[20]。14-3-3蛋白上调有利于将细胞分裂阻滞于细胞间期。SCF是有丝分裂S期重要的上游调控蛋白复合物，主要通过调节KIP/CIP蛋白的泛素化，消除KIP/CIP蛋白对cyclin-CDK的抑制效应。因此，SCF上调有利于加速细胞的增殖分裂。cMyc调节cyclin D的表达，进一步调控细胞有丝分裂的过程。综上所述，SCF表达水平的上调以及cMyc表达水平的下调均有利于细胞进行分裂，这可能也是食物充足有利于螅状体无性繁殖的分子机制之一。

图  6  海月水母转录组中Cell cycle信号通路

（红色表示基因表达上调，蓝色表示基因表达下调）

Fig.  6  Cell cycle signaling pathway in the transcriptome of A. coerulea

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3   结 论

（1）在15 ℃条件下，匍匐茎出芽生殖是海月水母最主要的无性繁殖方式。食物水平越高，出芽生殖产生的子代个体越多。食物越充足横裂间期持续时间越长，释放碟状体的数量越多。

（2）转录组数据分析表明，在不同食物水平下，海月水母螅状体无性繁殖的差异基因主要富集在MAPK和Cell cycle这两条信号通路上。当食物水平升高时，MAPK、Cell cycle信号途径均向着促进细胞分裂和分化方面作出响应，这是食物充足促进螅状体无性繁殖的重要分子调控机制。