大田软海绵酸（okadaic acid，OA）、鳍藻毒素-1（dinophysis toxin-1，DTX-1）和鳍藻毒素-2（dinophysis toxin-2，DTX-2）是腹泻性贝类毒素（diarrhetic shellfish poisoning，DSP）的主要组分，均为同系物。依据欧盟标准，腹泻性贝类毒素的安全食用限量标准为160 μg/kg（相当于OA），其中，DTX-1相对于OA毒性系数为1，DTX-2为0.6^[1]。1997年，连云港四角蛤蜊（Mactra veneriformis）中DTX-1最高含量达160 µg/kg^[2]。2000年至今，我国已报道了3起贝类体内OA含量超出欧盟等国际限量标准（160 µg/kg）的调查。2000年，大连的菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）体内OA最高含量为440 µg/kg^[3]；2009年，浙江南麂岛缢蛏（Sinonovacula constricta）体内OA最高含量为2770 µg/kg，贻贝（Mytilus edulis）体内最高含量为5850 µg/kg，泥蚶（Tegillarca granosa）体内最高含量为1060 µg/kg^[4]；2012年，由宁波销往宁德的贻贝（Mytilus galloprovincialis）体内检出OA和DTX-1含量分别为2150 µg/kg和1950 µg/kg^[5]。2015－2016年，DTX-2在钦州湾香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）体内的检出率为34.3%，最高含量为12.08 µg/kg^[6]。由此可见，DSP污染是威胁我国海产品食用安全的突出问题之一。

目前，DSP的分析方法主要包括小鼠生物法、酶联免疫吸附法和液相色谱−串联质谱法等。小鼠生物法无法确定毒素组分，受基质效应影响大，检测结果假阳性严重；酶联免疫吸附法检测简捷，灵敏度高，但也难以确定毒素的组分；液相色谱−串联质谱法可对毒素进行准确定性、定量分析，检出限低，但样品前处理繁琐，仪器昂贵。时间分辨荧光免疫层析技术（time-resolved fluorescent immunochromatography assay，TRFICA）是超微量检测新方法，其原理为：在虹吸作用下，待检样品溶液与结合垫和层析膜上的抗原及二抗先后发生特异性结合反应，并分别在层析膜上形成检测线和质控线，通过免疫荧光定量仪读取数据，即可得到检测结果。该技术具有灵敏度高、抗基质干扰性强、稳定性好等优点，在农药残留及真菌毒素等快速检测领域，已有广泛的应用^[7-8]。时间分辨荧光免疫层析技术在贝类毒素检测方面也有应用研究^[9-10]，但仅针对毒素单一组分的检测，而贝类毒素大多是由多组分构成，难以有效满足多组分贝类毒素检测的要求。因此，研制多组分快速检测技术产品，可满足腹泻性贝类毒素多组分毒素检测的实际需求，对于加强我国海产品贝类毒素监测，具有切实的应用价值。

1   材料与方法

1.1   试剂与材料

碳二亚胺（阿拉丁试剂（上海）有限公司），N-羟基琥珀酰亚胺（阿拉丁试剂（上海）有限公司），时间分辨荧光微球（长沙美牛生物科技有限公司），OA单克隆抗体（本实验室自制）^[11]，牛血清白蛋白（VETEC），Protein A蛋白柱（武汉百杰康生物科技有限公司），硝酸纤维素膜（赛多利斯），蔗糖（生工生物工程（上海）股份有限公司），磷酸缓冲液（PBS）（Solarbio），PC300（ProClin300）（Supelco），羊抗鼠IgG单克隆抗体（Thermo Fisher），酪蛋白（Sigma），聚乙烯亚胺（PVPK40）（美仑生物），硼酸（沈阳沈一精细化学品有限公司），荧光结合垫（2%蔗糖，0.2%酪蛋白钠盐，0.2% PVPk40，0.01 mol/L硼酸盐缓冲液），微球保存液（10%蔗糖，0.5%酪蛋白钠盐，0.5% PVPK40，0.01 mol/L PB），抗原抗体稀释液（2%蔗糖，0.05% PC300，0.01 mol/L PB）。大田软海绵酸（OA）、鳍藻毒素（DTX-1和DTX-2）、扇贝毒素-2（pectenotoxin-2, PTX-2）及氮杂螺环酸毒素（azaspiracids, AZA-1、AZA-2和AZA-3）溶液标准物质（加拿大海洋生物研究所），高纯（≥99%）OA、鳍藻毒素（DTX-1和DTX-2）、虾夷扇贝毒素（yessotoxin, YTX）和类虾夷扇贝毒素（homoyessotoxin, hYTX）固体粉末（本实验室自制）^[12-13]。

1.2   仪器设备

免疫荧光定量分析仪（湖南迪赛生物科技有限公司）；喷金仪、斩切机、压壳机和封膜机（上海金标生物技术有限公司）；电子天平（梅特勒−托利多，XS3DU）；液相色谱−串联质谱仪（API4000，AB）。

1.3   方法

1.3.1   OA抗体纯化方法

本实验通过Protein A柱纯化OA单克隆抗体，其具有高度结合亲和性，在结合和洗脱条件下，依据抗体亚型来纯化单克隆抗体，抗体纯度可达90%以上。

1.3.2   时间分辨荧光免疫层析试纸条制备方法

取含量为1%的荧光微球100 μL稀释于900 μL纯水中，分别加入10 μL的N-羟基琥珀酰亚胺（50 mg/mL）和碳二亚胺（50 mg/mL），置于旋转摇床（100 rpm）室温活化30 min，离心20 min（10000 r/min），去除上清溶液，用1 mL超纯水复溶。复溶的溶液经超声处理后加入8 μg 的OA鼠单抗，再置于旋转摇床上偶联1 h。偶联结束后用牛血清白蛋白封闭1 h。最后离心20 min去除上清液，用500 μL微球保存液复溶，置于4 ℃冰箱中保存备用。用微球保存液8倍稀释OA抗体荧光微球标记物，用喷金仪喷涂于处理好的荧光垫上，置于40 ℃烘箱中烘干过夜，装入密封干燥包装袋中保存备用。

OA-BSA（okadaic acid-bovine serum albumin）用抗原抗体稀释液溶解至终浓度1 mg/mL作为T线；二抗用抗原抗体稀释液溶解至终浓度1 mg/mL作为C线，用划膜机将T线和C线划于硝酸纤维素膜上，置于40 ℃烘箱烘干过夜，在室温干燥环境中保存备用。

在PVC背衬上，依次搭接并粘贴样品垫、喷有荧光标记物的荧光标记物结合垫、喷涂有检测T线和控制C线的硝酸纤维素膜、吸水纸，组装完成后剪切成4 mm宽的试纸条，装入塑料卡壳中，然后装入内置有干燥剂的铝箔袋中抽真空封闭保存。

1.3.3   标准曲线的绘制

分别配制7种不同浓度的OA、DTX-1和DTX-2毒素标准溶液（0.00、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00 ng/mL），将配制好的OA、DTX-1和DTX-2毒素标准样品分别滴入加样区，15 min后，用免疫荧光分析仪读取T/C值，每个标准样品检测3次。以OA、DTX-1和DTX-2毒素浓度对数为横坐标，以荧光计数平均值为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.4   时间分辨荧光免疫层析试纸条的测定

测试前先将免疫荧光分析仪开机预热5 min。打开试纸条的包装袋，平放于桌面上，取100 μL待测样品，滴加至检测卡的加样孔中，15 min后，插入荧光分析仪中，即可读取数据。通过免疫荧光分析仪可直接读取试纸条上的T/C值即荧光计数值，将数值代入标准曲线方程即可计算出样品浓度。

1.3.5   灵敏度检验方法

取10份OA、DTX-1和DTX-2样品稀释液PBS作为空白对照，滴加在时间分辨荧光免疫层析试纸条中，检测其计数值。以10次测定平均值减去两倍标准差所对应的浓度作为检出限；以10次测定平均值减去3倍标准差所对应的浓度作为定量限，定量限应大于或等于标准曲线中最低浓度值^[14]。将空白对照溶液加入时间分辨荧光免疫层析试纸条样品池中，用免疫荧光定量分析仪测定荧光计数值。最后，将结果代入公式（1）计算样品中毒素的含量：

式中：X为样品中毒素的含量（μg/kg）；ρ为由标准曲线计算出的样品中毒素质量浓度（μg/mL）；V 为样品提取液的体积（mL）；f为稀释倍数；m为样品的称样量（g）；1000为换算因子。

1.3.6   精密度检验方法

使用同一批次时间分辨荧光免疫层析试纸条，对同一被测对象进行10次以上的独立实验，采用测试结果的一致程度来检验时间分辨荧光免疫层析试纸条的精密度，用变异系数表示，其计算公式如下：

式中：CV为变异系数（%）；S为标准偏差；$\overline X $为平均荧光计数值。

配制1.25 ng/mL的OA、DTX-1和DTX-2毒素标准品溶液，分别滴加到10个时间分辨荧光免疫层析试纸条样品池中，测定荧光计数值，再利用公式（2）计算批内变异系数。选用3个不同批次的时间分辨荧光免疫层析试纸条，对同一被测对象进行每批次10次以上的定量检测，计算出批间变异系数。

1.3.7   特异性检验方法

半数抑制浓度（half inhibit concentration, IC₅₀）指用药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度，是反映抗体抑制能力强弱的指标，IC₅₀越小表明该抗体对毒素反应的特异性越强。用时间分辨荧光免疫层析试纸条法检测OA、DTX-1、DTX-2、AZA-1、AZA-2、AZA-3、PTX-2、YTX、hYTX 9种脂溶性毒素对包被抗原的竞争抑制反应。以9种标准物质浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制交叉抑制反应曲线，通过计算这9种脂溶性毒素的IC₅₀来判断抗体特异性。

1.3.8   稳定性检验方法

时间分辨荧光免疫层析试纸条的稳定性测试参考试剂盒的稳定性测试条件与方法。对试纸条进行37 ℃破坏实验，将组装好的5组试纸条置于37 ℃恒温培养箱内，于第1 d、第3 d、第7 d、第10 d、第14 d取出，分别进行荧光测试^[15]。

1.3.9   正确度检验方法

取空白样品进行加标回收试验，用同一批次时间分辨荧光免疫层析试纸条进行定量检测。在标准曲线范围内，依据选定的高（3200 μg/kg）、中（400 μg/kg）、低（200 μg/kg）3个不同浓度，添加高纯度（≥99%） OA、DTX-1和DTX-2固体粉末于长牡蛎、虾夷扇贝、文蛤、菲律宾蛤仔贝肉中，充分混匀，使其在样品中的最终含量分别为3200 μg/kg、400 μg/kg、200 μg/kg。用同一批次的时间分辨荧光免疫层析试纸条重复检测3次，计算加标回收率和批内变异系数。

1.3.10   验证方法

对实际样品分别添加OA、DTX-1、DTX-2、OA+DTX-1、OA+DTX-2及OA+DTX-1+DTX-2毒素样品，采用液相色谱−串联质谱法检测结果来验证时间分辨荧光免疫层析试纸条的灵敏度和正确性^[1]。

2   结果与讨论

2.1   标准曲线的绘制

在0.1～10 ng/mL（100～10000 pg/mL）浓度范围内，以标准品浓度的对数为横坐标，标准品的荧光计数值为纵坐标，绘制标准曲线。3种毒素标准曲线方程如下：

OA: y=−0.6859x+2.8755，R²=0.9912，IC₅₀为3.46 ng/mL

DTX-1: y=−0.8852x+3.4979，R²=0.9752，IC₅₀为3.39 ng/mL

DTX-2: y=−0.7593x+2.9812，R²=0.9352，IC₅₀为3.25 ng/mL

由图1可知，在0.1～10 ng/mL浓度范围内，3种毒素的时间分辨荧光免疫层析试纸条检测的线性拟合关系良好。

图  1  OA、DTX-1和DTX-2毒素标准物质时间分辨荧光免疫定量检测标准曲线

Fig.  1  Quantitative test standard curves of time-resolved fluorescent immunochromatography for OA，DTX-1 and DTX-2 toxins reference materials

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2.2   灵敏度

经检测，10个空白样品的平均荧光计数值（T/C值）为1.2848，标准差为0.077，分别以空白样品标准差的2倍和3倍可计算出时间分辨荧光免疫层析试纸条检出限浓度与定量限浓度，将浓度代入公式（1）分别计算出检出限含量与定量限含量。如表1所示，时间分辨荧光免疫层析试纸条对3种毒素都有较低的检出限与定量限，均低于欧盟等国际限量标准，表明此时间分辨荧光免疫层析试纸条具有较高的灵敏度。

表  1  时间分辨荧光免疫层析试纸条灵敏度测试

Tab.  1  Sensitivity test for the time-resolved fluorescent immunochromatography strips

毒素	检出限浓度/ ng·mL−1	检出限含量/ μg·kg−1	定量限浓度/ ng·mL−1	定量限含量/ μg·kg−1
OA	0.350	69.94	0.453	90.56
DTX-1	0.472	94.43	0.577	115.37
DTX-2	0.238	55.53	0.349	69.76

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2.3   精密度

如表2所示，时间分辨荧光免疫层析试纸条针对OA、DTX-1和DTX-2毒素测试的批内变异系数分别为9.4%、5.3%和5.2%，均低于20%，表明批内精密度良好。使用不同批次试纸条测试OA、DTX-1和DTX-2毒素，批间变异系数分别为14.3%、11.0%和10.1%，表明批间也具有良好的精密度。

表  2  时间分辨荧光免疫层析试纸条精密度测试

Tab.  2  Precision test for the time-resolved fluorescent immunochromatography strips

	毒素	荧光计数值	标准偏差	变异系数/（%）
批内	OA	0.758	0.071	9.4
	DTX-1	1.110	0.059	5.3
	DTX-2	0.472	0.025	5.2
批间	OA	1.017	0.145	14.3
	DTX-1	1.321	0.147	11.0
	DTX-2	0.679	0.069	10.1

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2.4   正确度

加标回收实验结果表明（表3），同一批次时间分辨荧光免疫层析试纸条测定不同样品中OA的回收率为72.4%～119.7%，变异系数为3.4%～12.1%；DTX-1的回收率为74.0%～112.5%，变异系数为4.4%～8.5%；DTX-2回收率为76.9%～119.0%，变异系数为4.0%～7.4%。毒素在长牡蛎、虾夷扇贝、文蛤和菲律宾蛤仔贝肉中的回收率均为60%～120%，变异系数均小于20%，表明正确度良好，符合国家相关标准要求^[14]。

表  3  OA、DTX-1和DTX-2毒素添加实验结果

Tab.  3  Results for OA，DTX-1 and DTX-2 toxins addition experiment

样品		OA添加浓度/μg·kg−1				DTX-1添加浓度/μg·kg−1				DTX-2添加浓度/μg·kg−1
		3200.0	400.0	200.0		3200.0	400.0	200.0		3200.0	400.0	200.0
长牡蛎	回收率/（%）	116.6	90.1	72.4		101.4	95.9	85.4		110.9	100.0	98.5
	变异系数/（%）	5.2	9.7	4.1		6.4	5.3	4.4		4.5	4.3	6.0
虾夷扇贝	回收率/（%）	118.2	98.0	99.3		112.5	74.7	98.9		119.0	98.5	90.0
	变异系数/（%）	5.5	11.0	8.7		5.1	5.6	7.6		6.0	5.1	5.0
文蛤	回收率/（%）	116.0	102.3	99.8		99.8	84.4	99.9		109.7	99.6	84.3
	变异系数/（%）	3.9	3.4	6.3		6.4	6.5	7.0		4.9	5.4	5.0
菲律宾蛤仔	回收率/（%）	119.7	109.2	99.1		100.6	74.0	100.0		108.4	100.3	76.9
	变异系数/（%）	12.1	4.6	9.3		8.5	7.9	8.5		4.0	7.4	4.0

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2.5   特异性

测试结果如表4所示，本研究研制的时间分辨荧光免疫层析试纸条对OA、DTX-1和DTX-2的IC₅₀均较小，表明检测结果的特异性较好；对其余6种毒素（AZA1、AZA2、AZA3、PTX2、YTX、hYTX）的IC₅₀均较高，表明检测结果均低于试纸条的最低检出限，特异性差。由此说明本文研制的时间分辨荧光免疫层析试纸条与上述6种毒素均无交叉反应，对OA、DTX-1和DTX-2特异性较强。

表  4  九种海洋脂溶性毒素IC₅₀

Tab.  4  IC₅₀ values for nine marine lipophilic toxins

毒素种类	IC50 /ng·mL−1
OA	2.34
DTX1	3.39
DTX2	3.25
AZA1	8204
AZA2	15573
AZA3	26530
PTX2	23160
YTX	32405
hYTX	50770

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2.6   稳定性

依据试剂盒稳定性测试条件与方法，37 ℃下的24 h约相当于常温时间45 d^[15]。在1 d、3 d、7 d、9 d、14 d内，试纸条测试的平均荧光计数值变化不明显（图2），表明试纸条在真空封闭、室温干燥条件下，保质期可达两年（24个月）。

图  2  14 d内时间分辨荧光免疫层析试纸条稳定性结果

Fig.  2  Stability of the time-resolved fluorescent immunochromatography strip during 14 days

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2.7   应用与验证

对来自全国沿岸海域的扇贝、贻贝、牡蛎、蛤类等50个样品进行时间分辨荧光免疫层析试纸条检测，OA浓度范围为0～742.9 μg/kg，时间分辨荧光免疫层析试纸条检测结果y与液相色谱−串联质谱法检测结果x的相关性方程为y=0.707x−10.087（R²=0.8795）(图3a)。其中，有1个样品的液相色谱−串联质谱法检测结果为15.6 μg/kg，而时间分辨荧光免疫层析试纸条法未检出，主要原因是样品中毒素含量低于试纸条的检出限(69.94 μg/kg)；另有17个样品，两种方法均未检出毒素。

图  3  时间分辨荧光免疫层析试纸条法与液相色谱−串联质谱法检测腹泻性贝类毒素结果比对

Fig.  3  Comparison of tested DSP results between the time-resolved fluorescent immunochromatography strip method and LC-MS/MS

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分别取5个虾夷扇贝、紫贻贝、长牡蛎、菲律宾蛤仔及3个江瑶，在贝肉中添加高纯（≥99%）OA、DTX-1和DTX-2毒素，经充分均匀后，对已添加毒素的23个样品进行时间分辨荧光免疫层析试纸条与液相色谱−串联质谱法比对检测。DTX-1浓度范围为118.0～590.0 μg/kg，时间分辨荧光免疫层析试纸条检测结果y与液相色谱−串联质谱法检测结果x的相关性方程为y = 0.9452x + 148.19（R² = 0.7775）(图3b)。DTX-2浓度范围为108.0～600 μg/kg，时间分辨荧光免疫层析试纸条检测结果y与液相色谱−串联质谱法检测结果x的相关性方程为y = 0.996x + 92.757（R² = 0.7465）(图3c)。

(OA+DTX-1)浓度范围为112.7～648.3 μg/kg，时间分辨荧光免疫层析试纸条检测结果y与液相色谱−串联质谱法检测结果x的相关性方程为y = 0.86x + 117.46（R² = 0.7511）(图3d)。（OA+DTX-2）浓度范围为104.8～602.8 μg/kg，时间分辨荧光免疫层析试纸条检测结果y与液相色谱−串联质谱法检测结果x的相关性方程为y = 0.9913x + 173.81（R²= 0.7312）（图3e）。（OA +DTX-1+DTX-2）浓度范围为129.2～743.4 μg/kg，时间分辨荧光免疫层析试纸条检测结果y与液相色谱−串联质谱法检测结果x的相关性方程为y = 0.7x + 183.18（R² = 0.767）（图3f）。

依据上述OA、DTX-1和DTX-2毒素样品检测结果可知，时间分辨荧光免疫层析试纸条法与液相色谱−串联质谱法检测一种、两种或三种毒素总量的相关性良好，表明实时时间分辨荧光免疫层析试纸条检测的结果可靠，但无法确定每一种毒素的具体含量。

我国近海贝类体内已出现OA和DTX-1^[16-17]、OA和DTX-2^[6,16-17]同时检出的情况。目前，我国仍然使用小鼠生物法对海产品中腹泻性贝类毒素进行检测。由于脂溶性毒素特异性差，导致小鼠生物法假阳性问题严重，因此，欧盟在2015年起已停止使用该检测方法^[1]。1993－2019年，使用小鼠生物法检测我国沿岸海域贝类体内腹泻性贝类毒素的检出率和超标率均为40.4%；酶联免疫吸附法的检出率为61.0%，超标率为9.9%；液相色谱−串联质谱法的检出率为43.7%，超标率为3.5%。对比3种方法的检测结果可知，小鼠生物法检测的腹泻性贝毒超标率是酶联免疫吸附法4倍，液相色谱−串联质谱法的11.5倍^[18]。因此，鉴于小鼠生物法存在的缺陷，实时时间分辨荧光免疫层析试纸条检测腹泻性贝类毒素结果可靠，操作简单方便，可以替代小鼠生物法。

3   结 论

（1）本文在制备腹泻性贝类毒素OA单克隆抗体的基础上，研制出检测OA、DTX-1、DTX-2的时间分辨荧光免疫层析试纸条，测试OA、DTX-1、DTX-2的IC₅₀值分别为3.46 ng/mL、3.39 ng/mL和3.25 ng/mL，线性检测范围均为0.1～10 ng/mL，检测限分别为69.94 μg/kg、94.43 μg/kg和55.53 μg/kg，定量限分别为90.56 μg/kg、115.37 μg/kg和69.76 μg/kg，回收率范围分别为72.4%～119.7%、74.0%～112.5%和76.9%～119.0%，批内、批间变异系数均小于20%。

（2）不同种类贝类样品的应用验证结果表明，时间分辨荧光免疫层析试纸条可定量检测样品中OA、DTX-1和DTX-2，与液相色谱−串联质谱法相关性良好。本试纸条检测方法具有样品前处理过程简单、操作方便、成本低、特异性好、灵敏度高、检测时间短等特点，适合现场监测及大批量样品的初筛，可为我国海洋环境及海产品中腹泻性贝类毒素的快速检测提供可靠的技术支撑，具有切实的应用前景。