工业革命以来，化石燃料的燃烧使得空气中二氧化碳(CO₂)浓度快速增加。目前，大气中CO₂浓度约400 μatm，按照目前的增长速度，到21世纪末空气中CO₂浓度将增加至1000 μatm。水体吸收大量的CO₂，其中海洋吸收大约1/3人为产生的CO₂^[1]。目前表层海水的pH比工业革命前下降0.1，酸度增加30%，酸度变化的速率是过去的650000 a间酸度变化速度的100多倍^[2]。而且，表层海水的CO₂分压(pCO₂)正随着大气中CO₂浓度的升高而呈线性增加。以当前CO₂排放速率，模型预测2100年大气中CO₂将会增加至936 μatm，到2250年将会增加至约2000 μatm。相应地，到2100年表层海水pH将会比1950年代下降0.14~0.32，至2300年表层海水pH将会继续下降0.7到0.8^[3]。海洋酸化引起的海洋化学变化，正在影响海洋生物赖以生存的化学环境，海洋生物的代谢过程会受到影响，海洋生态系统的稳定性也会发生变化^[4]。

海洋酸化使得海水中CO₂、HCO₃^-和H⁺浓度增加，同时CO₃^2-浓度降低，因此碳酸钙(CaCO₃)的饱和度下降，影响生物矿化过程^[5]。鱼类内耳中有3对钙质的耳石，主要功能是感知方位和加速度。耳石的主要成分是CaCO₃ (96%)，研究发现海洋酸化影响鱼类耳石的形状、密度、日增长等，并进而可能影响其听觉敏感度以及听觉相关行为^[6-9]。在高CO₂分压(约2000~4200 μatm)酸化处理组，多种海水鱼的仔稚鱼耳石的大小、表面积等显著增加^[6-7]。例如，小丑鱼(Amphiprion percula)仔鱼在pH 7.8，1050 μatm CO₂酸化水体中养殖11 d，内耳耳石的形状、大小、左右耳石对称性和耳石元素成分与对照组差异不显著。然而在pH 7.6，1721 μatm CO₂酸化组中，耳石表面积、最大长度均高于对照组^[8]。海鲈鱼(Atratoscion nobilis)仔鱼在高浓度酸化组(2500 μatm CO₂)，耳石的表面积也显著大于对照组。目前，酸化对鱼类耳石影响的机制还不清楚，推测是与高CO₂分压的海水中鱼类内耳淋巴液中CaCO₃饱和度增加有关^[9]。利用数值模型推算在一定水流下耳石的运动，发现随着耳石的增大，军曹鱼(Rachycentron canadum)仔鱼耳石与感觉毛细胞间的相对运动增加，即鱼的听力敏感度增加，使得在高CO₂分压水体中的鱼能听到在低CO₂分压水体中所听不到的声音，但听力改变对鱼类生存是利或是弊还很难判断^[6]。

海洋鱼类具有较完善的酸碱调节机制。目前，有关海洋酸化对鱼类钙化器官耳石的影响的研究主要是针对酸碱调节机制尚未成熟的幼鱼阶段展开研究^[10]。然而，海洋鱼类的成鱼大多在近岸生活，而近岸水域容易受到人类活动影响，从而吸收更多的人为排放的CO₂，使得局部地区海洋酸化更为严重^[11]。因此，高浓度海洋酸化对近岸鱼类成鱼生长的影响更应该引起关注。目前，高浓度CO₂的酸化处理对成鱼的耳石是否有影响还未见报到。本文利用海水模式生物海水青鳉鱼(Oryzia melastigma)作为研究对象，模拟未来100~300 a的海水酸化，研究海水中高浓度CO₂对青鳉鱼成鱼内耳中耳石形态及主要元素成分的影响，为全面、深入了解酸化对鱼类耳石影响机制奠定基础。

1   材料与方法

1.1   实验用鱼

海水青鳉成鱼每天在早、中、晚，投喂3次初孵卤虫，每次投喂至饱食。养殖水温18~20℃，光照黑暗时间比=14 h: 10 h，每天吸底、换水、收卵。

1.2   实验设置与水化学

实验周期为45 d。取体积为10 L鱼缸加入约8 L新鲜配制的海水作为实验水体，每缸放入龄期相近的10尾成鱼(5尾雌鱼和5尾雄鱼)，以避免实验生物体重对实验结果的影响。体长为2.5 ± 0.1 cm。

设置4个实验组，其中1个对照组，3个处理组，每个实验组各设3个平行。经CO₂加富器(CE100-5，武汉瑞华)在实验水体中通入从室外接入的空气，作为对照组。经非色散式CO₂测试计(TES-1370，台湾泰仕)测定对照组CO₂浓度为450±12 ppm。3个处理组，分别经CO₂加富器通入CO₂，设定CO₂浓度为1000 ppm、3000 ppm和5000 ppm，实际CO₂浓度为980±30 ppm、2900±80 ppm和4850±100 ppm。

实验用水是由曝气自来水加入海盐新鲜配制而成，各个实验组水体平均盐度为31，平均水温19℃。利用pH计(METTLER TOLEDO)每天测量实验水pH_NBS，pH计每天采用pH 4.01, 6.86和9.18的标准缓冲液(Mettler-Toledo AG, Analytical, CH-8603 Schwerzenbach)进行校准。测量前水体样品经0.45 μm滤纸过滤，然后用于溶解无机碳(dissolved inorganic carbon, DIC)和总碱度(total alkalinity, TA)的测定。总碱度采用Gran滴定法，利用标准海水在海水总碱度滴定仪(AS-ALK2, Appolo SciTech)上进行滴定测定。海水无机碳含量用TOC分析仪(TOC-V CPH, 岛津)测定。利用CO₂系统分析软件CO2SYS，根据已知的pH_NBS、TA，对实验水体中其他碳酸盐参数进行计算^[12]。

1.3   鱼体长、体重测量

实验鱼来自于同一批孵化出膜的卵而长成的成鱼(4月龄，已经开始产卵)，实验开始前及45 d实验后分别将所有实验鱼用MS222(0.1 g/L)麻醉剂麻醉后，用直尺测量每尾鱼体长；用电子天平称量每尾鱼体重。

1.4   耳石参数测量

45 d实验后，将每尾实验鱼在解剖镜下进行解剖，各解剖出3对耳石，分别为矢耳石、星耳石和微耳石。将耳石用体视显微镜(Stereo Discovery.V12, ZEISS)拍照，并利用显微镜自带软件(Axio Vision Rel.4.7)测量每个耳石的长、宽、周长、面积、外切圆半径和内切圆半径等数值。青鳉鱼内耳中矢耳石、星耳石和微耳石的形状见图 1。实验前后对实验鱼耳石测量的起止点见图 2。

图  1  青鳉鱼内耳中3个耳石(从左向右分别是星耳石、矢耳石和微耳石)

Fig.  1  The otoliths of medaka (From the left to the right, they are asteriscus, sagittae, and lapillus, respectively)

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图  2  耳石测量的起始点(以矢耳石为例，比例尺100 μm)

(A.长和宽；B.周长和面积；C.内切圆半径；D.外切圆半径)

Fig.  2  The start and end of the measurement of otoliths (take the sagittae as examples)

(A.The length and width; B.the perimeter and the surface area; C.the inscribed circle radius; D.the circumscribed radius.Scale bar, 100 μm)

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其中，耳石圆形趋近率的计算公式：

R=Cin/Cout

式中：R为圆趋近率；Cin为内接圆半径；Cout为外切圆半径。

另外，左、右耳石的对称性的计算公式：

A=2×(Ol-Or)/(Ol+Or)

式中：A为对称性；Ol为左耳石；Or为右耳石然后，采用左、右耳石的对称性的计算公式对矢耳石左、右耳石的表面积和圆趋近率进行计算。

将体积较大的矢耳石经超纯水洗净、烘干，用梅特勒千分之一天平(Sartorius CPA2P Microbalance)逐一称重。

将矢耳石经超纯水洗干净，烘干，喷金，经扫描电镜(S-3400N，日立)能谱分析测定耳石中各元素的相对含量。能谱分析时能量值10~15 KV，输入能量>0.6 KV。每个耳石均在边缘及中心多点进行测量。

1.5   数据统计

所有数值采用平均值±标准差表示，用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比较对实验前后实验鱼体长和重量、3对耳石形状参数、矢耳石重量、矢耳石中主要元素成分进行组间数据差异显著性分析。采用成对T检验，对左、右矢耳石的对称性进行了显著性分析。以P < 0.05为差异显著标准，以P < 0.01为差异极显著标准。

2   结果与讨论

2.1   水质指标

通入室外空气的对照组(CO₂浓度为450 ppm)与通入CO₂浓度分别为980 ppm、2900 ppm和4850 ppm的3个处理组，对应的水体平均pH分别为8.12、7.92、7.62和7.38。在整个试验期间，各组水体的pH维持相对稳定(图 3)。对照组与3个处理组的CO₂分别为：406.8 μatm，1004.4 μatm，2923.4 μatm和4902.1μatm。随着CO₂浓度升高，各实验水体中CO₃^2-浓度和海水文石饱和度(Ωarg)均呈下降的趋势(表 1)。

图  3  实验期间各实验组水体的pH变化

Fig.  3  The change of pH during the experiment

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表  1  每个实验组各碳酸盐系统参数

Tab.  1  Summary of seawater chemistry results

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2.2   实验前后实验鱼体长、体重的变化

实验开始时实验鱼平均体长2.47±0.18 cm，平均体重0.30±0.02 g，体长、体重对照组与各个CO₂处理组之间差异不显著。经45 d实验后，实验鱼平均体长和平均体重在各组之间差异仍不显著(表 2)。原产于印度和孟加拉国沿海海水青鳉鱼，与其他海洋鱼类相似，具有较高的酸碱调节能力，酸化对其生长影响不显著^[13-14]。

表  2  实验前后实验鱼体长和体重的变化

Tab.  2  The standard length and body weight of medaka during the experiment

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2.3   酸化处理对青鳉鱼耳石形态影响

2.3.1   酸化对青鳉鱼内耳中3对耳石形状的影响

酸化对青鳉鱼内耳中3对耳石形状的影响如图 4所示。在酸化水体中养殖45 d后，青鳉鱼耳石表面积(图 4A)和圆趋近率(图 4B)与对照组差异均不显著(P>0.05)。矢耳石的表面积大约是微耳石和星耳石的6倍。在980 ppm酸化处理组，矢耳石和微耳石的表面积均呈现出高于对照组的趋势，继续增加水体中CO₂浓度，两者的表面积又开始下降至对照组水平。耳石圆趋近率的数值越接近1，表明耳石的形状越接近规则的圆形；圆趋近率的数值越接近0，表明耳石形状接近长形。在青鳉鱼3对耳石中，星耳石最接近圆形，矢耳石次之。在980 ppm酸化水体中，星耳石圆趋近率升高，在2900 ppm、4850 ppm酸化水体中，星耳石圆趋近率又呈现下降的趋势。矢耳石在980 ppm酸化水体中，圆趋近率呈现上升的趋势。

图  4  酸化对青鳉鱼耳石表面积(A)和圆趋近率(B)的影响

Fig.  4  Surface area (A) and Roundness (B) of otoliths in medaka reared at 4 CO₂ concentrations

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2.3.2   酸化对青鳉鱼左右矢耳石对称性的影响

45 d的酸化处理，对青鳉鱼矢耳石表面积和圆趋近率的左、右耳石对称性有影响(图 5)。酸化处理组的左侧矢耳石表面积和圆趋近率大于右侧矢耳石，其中在2900 ppm(pH=7.62)处理组，左侧矢耳石表面积和圆趋近率极显著高于右侧矢耳石的表面积和圆趋近率(P < 0.01)。耳石是鱼类感知加速度、平衡和听觉的重要器官。耳石大小、密度和质量的改变都会直接影响耳石的感知功能^[15]。2100 μatm CO₂酸化处理军曹鱼，耳石重量增加，同时耳石密度也显著增加。根据数学模式计算，增大的耳石能够提高军曹鱼听觉敏感度^[6]。虽然海水酸化对青鳉鱼耳石的形状影响不显著，但是对左右矢耳石的形状对称性影响明显。在以往的报道，酸化对鱼类幼鱼的耳石形状及左右耳石对称性均未见显著影响^{[7-8, 16]}。在幼鱼阶段，左右耳石对称性的变化是反映鱼体状态的一个指标，在应激状态下，会增加耳石不对称性的波动^[17]。鱼体内存在特殊的生理生化机制调节左右耳石的生长，以减少两侧耳石的不对称性，以避免对鱼类听觉功能的影响^[15]。

图  5  酸化对青鳉鱼左右耳石表面积不对称性(A)和圆趋近率不对称性(B)的影响

Fig.  5  Asymmetry ([left-right]/mean _{left, right}) in (A) otolith surface area and (B) otolith roundness between left and right sagittae of medaka reared at 4 CO₂ concentrations

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2.4   酸化处理对青鳉鱼矢耳石重量的影响

经过45 d酸化处理，随着水体中CO₂浓度升高，矢耳石重量呈下降趋势(图 6)，其中2900 ppm、4850 ppm处理组矢耳石重量显著低于对照组(P < 0.05)。2900 ppm处理组矢耳石重量与对照组相比下降10.5%，4850 ppm处理组比对照组下降14.6%。大量研究发现，酸化海水对鱼类内耳耳石的早期发育有显著影响，使得耳石表面积增大、密度增加和重量变重等^{[6-7, 9]}。Checkley等认为酸化情况下，鱼类内耳淋巴液为了维持pH的稳定，CO₃^2-浓度会升高，因而CaCO₃饱和度会升高，加快耳石中CaCO₃的累积，从而使得耳石重量增重^[9]。本研究发现，在高浓度CO₂的酸化水体中养殖青鳉鱼成鱼45 d，青鳉鱼内耳中矢耳石、星耳石和微耳石的形状，包括耳石表面积和圆趋近率，没有受到酸化的影响。然而，随着水体中CO₂浓度升高，矢耳石的重量则呈现下降的趋势，其中2900 ppm和4850 ppm高浓度组矢耳石重量显著低于对照组。耳石重量的变化能够更好的反映鱼体生长率的变化，并且与鱼体代谢率紧密相关^[18]，表明长时间的高浓度CO₂的酸化将会影响青鳉鱼成鱼的生理代谢。

2.5   酸化处理对青鳉鱼矢耳石主要元素成分的影响

水体中离子成分变化能够影响内耳淋巴液成分进而影响耳石中元素成分和沉积速度^[19]。随着海水中CO₂分压的升高，海水pH降低，海水中CO₃^2-浓度也随之下降。鱼类生活水体的温度、盐度或周围元素成分变化等都会影响到耳石的化学成分^[20]。本研究对矢耳石元素成分分析发现，海水青鳉鱼矢耳石的主要元素成分分别是：O、Ca和C，而后是P和Sr，它们的含量不足1%(表 3)。在以上主要元素成分中，Ca含量受酸化影响变化不显著。而在2900 ppm、4850 ppm处理组，C的含量均显著低于对照组。其他元素含量在酸化处理组和对照组之间差异不显著。

图  6  酸化对青鳉鱼矢耳石重量的影响

Fig.  6  Sagittal otolith weight of medaka reared at 4 CO₂ concentrations

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表  3  酸化处理对青鳉鱼矢耳石主要元素成分的影响

Tab.  3  The main elements of sagittal otolith in medaka reared at 4 CO₂ concentrations

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3   结论

(1) 模拟未来100~300 a的CO₂导致的海水酸化程度，处理海水青鳉鱼成鱼45 d，青鳉鱼内耳中耳石形态和大小变化不显著，但是矢耳石重量随酸度的增加而减少，2900 ppm和4850 ppm处理组的矢耳石重量分别比对照组下降10.5%和14.6%。因此长时间高浓度CO₂的酸化可能会影响青鳉鱼成鱼的生理代谢。

(2) 在2900 ppm酸化处理组，左侧矢耳石的表面积和圆趋近率显著高于右侧的，左右耳石的不对称性可能影响青鳉鱼的听觉功能。

(3) 2900 ppm和4850 ppm酸化处理组的矢耳石C元素含量分别为10.6%和10.8%，显著低于对照组。由此表明，酸化水体中随着水体中CO₃^2-浓度下降，青鳉鱼成鱼内耳耳石中CaCO₃饱和度随之下降，最终导致耳石重量下降。